張宇輝， 劉　怡， 夏良華， 陳　明， 金佳美， 沃　達

(1. 同濟大學附屬東方醫(yī)院醫(yī)學超聲科，上?！?00120; 2. 同濟大學附屬東方醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學平臺，上?！?00120)

胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-4(insulin-like growth factor binding protein-4, IGFBP-4)作為一種全新的分泌型心肌細胞分化誘導(dǎo)因子,可以通過調(diào)控Wnt信號通路而參與心臟細胞的損傷修復(fù)過程[1]，從而阻止心肌梗死后心肌細胞DNA損傷的發(fā)生,起到干預(yù)心肌梗死患者預(yù)后的作用。準確評價IGFBP-4轉(zhuǎn)基因小鼠心肌梗死前后心功能的變化對于確定IGFBP-4誘導(dǎo)心肌細胞分化再生功能至關(guān)重要。近年來，小動物高頻超聲(high frequency ultrasound, HFUS)無創(chuàng)成像技術(shù)不斷發(fā)展，它通過中心頻率10MHz 以上的超聲對各種動物模型進行成像檢測，在觀察胚胎發(fā)育、組織疾病、腫瘤浸潤等基礎(chǔ)研究中都起到了不可或缺的作用[2-4]。本研究通過IGFBP-4轉(zhuǎn)基因小鼠建立心肌梗死動物模型，使用高頻超聲心動圖評價心肌梗死前后小鼠模型心功能變化，并與正常小鼠心功能變化作比較，旨在確定高頻超聲心動圖在干預(yù)心肌梗死IGFBP-4轉(zhuǎn)基因小鼠預(yù)后中的作用。

1　材料與方法

1.1　實驗動物與模型建立

1.1.1實驗動物ICR雄性小鼠(上海斯萊克實驗動物有限公司)及構(gòu)建成功的IGFBP-4/H74P點突變體在心臟特異表達的轉(zhuǎn)基因小鼠(同濟大學附屬東方醫(yī)院轉(zhuǎn)化平臺)各30只，體質(zhì)量20～25g，清潔級，分為對照組(n=30)和IGFBP-4轉(zhuǎn)基因組(n=30)。于同濟大學SPF動物中心按標準動物管理條例飼養(yǎng),所有動物操作都符合倫理組織的要求。

1.1.2模型建立無菌手術(shù)在同濟大學附屬東方醫(yī)院轉(zhuǎn)化平臺實驗動物室進行。以2%戊巴比妥鈉(80mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥固定，脫毛備皮，四肢連接心電圖，氣管插管連接呼吸機。麻醉約15min后，取右側(cè)臥位，距胸骨左緣0.2～0.4cm處沿第四肋間做橫行切口，開胸充分暴露心臟，少量游離心包，以左心耳前下角為標志以8-0proline縫線仔細結(jié)扎冠狀動脈左前降支近段，結(jié)扎后發(fā)現(xiàn)左心室前壁蒼白，對出現(xiàn)心律失常的小鼠及時予以利多卡因處理。經(jīng)心電圖檢查確認模型建立成功后關(guān)胸復(fù)蘇，保溫過夜。

1.2　主要儀器與方法

1.2.1主要儀器彩色超聲診斷儀Vevo 2100購自加拿大VisualSonics公司，探頭型號： MS-40012 L，探頭頻率： 30MHz。倒置式光學顯微鏡LX70-141購自日本奧林巴斯公司。

1.2.2高頻超聲心動圖檢查分別于術(shù)前1d及術(shù)后1、2周對存活的小鼠進行超聲心動圖檢查，采用雙盲法由助手將兩組小鼠混合編號進行麻醉及檢查。待檢測小鼠經(jīng)異氟烷吸入麻醉，心率在檢查過程中保持恒定，觀察并控制于(400±20)次/min為宜。使用加熱平板以保證小鼠檢查過程中體溫恒定。為了保證成像效果，保持小鼠固定姿勢，脫毛備皮，應(yīng)用適量的超聲耦合劑于胸口皮膚。檢查所得值均為取連續(xù)5個心動周期的均值。

胸骨旁長軸切面： 將高頻探頭置于小鼠左胸側(cè)，探頭切跡指向小鼠頭部，逆時針旋轉(zhuǎn)30°～45°即可，可以清楚顯示主動脈根部，左心室，室間隔及二尖瓣等結(jié)構(gòu)，見圖1。轉(zhuǎn)換至M型模式，取樣線置于二尖瓣腱索水平，垂直于室間隔及左心室后壁，曲線掃描速度為200mm/s，即得心室波群的M型曲線?？蓽y量得到相應(yīng)數(shù)據(jù)： 室間隔厚度(interventricular septum diameter, IVSd)，左心室后壁厚度(left ventricle posterior wall diameter, LVPWd)，左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at end diastolic, LVIDd)，左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at end systolic, LVIDs)，經(jīng)系統(tǒng)計算得出左心室射血分數(shù)(ejection fraction, EF)、左心室短軸縮短率(fractional shortening, FS)。

圖1　胸骨旁長軸切面圖Fig.1　Parasternal long axis viewA： 左心室收縮末期內(nèi)徑,B： 左心室舒張末期內(nèi)徑；黃色箭頭表示室間隔，綠色箭頭表示主動脈，紅色箭頭表示左心室后壁

胸骨旁短軸切面： 將探頭沿長軸切面順時針旋轉(zhuǎn)90°，切面與左心室長軸相垂直。向下略微移動探頭，可以沿長軸從不同的層面觀察左心室的橫斷面(如二尖瓣水平的左心室橫斷面、乳頭肌水平的左心室橫斷面、心尖水平的左心室橫斷面)，圖像深度調(diào)節(jié)至7.0～14.0cm，能全面觀察心肌運動情況，準確評估心臟的形態(tài)，是評價左心室收縮功能的最佳切面，見圖2?？蓽y量得到左心室質(zhì)量(left ventricular mass, LVM)、左心室容積(end-diastolic volume, EDV)及左心室收縮末容積(end-systolic volume, ESV)等數(shù)據(jù)。

圖2　胸骨旁短軸切面圖(乳頭肌水平)Fig.2　Parasternal short axis view(papillary muscle level)

心尖四腔切面： 將探頭置于橫切面上，探頭切跡面向小鼠左側(cè)，然后將探頭輕微移動至胸廓的外側(cè)壁。在該位置上進行微調(diào)可得到心尖四腔切面并于該切面測量二尖瓣血流速度。心尖四腔切面是評價收縮功能及左心室舒張功能十分重要的一個切面，見圖3。

圖3　心尖四腔切面圖Fig.3　The apical four chamber viewA為左心室，B為右心室，C為左心房，D為右心房；AC之間為二尖瓣，BD之間為三尖瓣

1.2.3左心室稱重術(shù)后1周進行超聲心動圖檢測后處死兩組存活小鼠，取出心臟后剪取左心室(保留室間隔)，充分拭去左心室表面及腔室內(nèi)的殘留血液及血塊，通過電子秤進行稱重得到左心室質(zhì)量LVM實測值，與通過高頻超聲心動圖所得的LVM測量值進行相關(guān)性分析以明確高頻超聲心動圖評估心功能的可靠性。

1.2.4病理學檢查從稱重后的左心室留取小鼠左心室心肌組織，截取左心室中段橫切面，4%甲醛固定脫水，石蠟包埋，經(jīng)H-E染色，光學顯微鏡下放大200倍，觀察拍攝。

1.3　統(tǒng)計學處理

2　結(jié)　　果

2.1　術(shù)后存活率

對照組及IGFBP-4轉(zhuǎn)基因組小鼠心肌梗死模型2周后死亡率均為10%(3∶30),即2周后2組均剩余27只小鼠。死亡原因分別為室顫、血栓形成、失血性休克及肺部感染等。

2.2　高頻超聲心動圖檢查結(jié)果

2.2.1冠狀動脈左前降支結(jié)扎術(shù)前后心功能變化手術(shù)前2組小鼠體質(zhì)量、心率、IVSd、LVPWd、LVIDd、LVIDs、EF、FS等差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。術(shù)后1周，2組小鼠心功能與術(shù)前相比均有顯著下降，表現(xiàn)在室壁變薄，心室腔擴大，EF及FS值下降(P<0.05)；而對照組術(shù)后2周心功能較第1周心功能明顯降低(P<0.05)，IGFBP-4轉(zhuǎn)基因組術(shù)后2周心功能與第1周差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2.2對照組及IGFBP-4組小鼠術(shù)后心功能參數(shù)比較術(shù)后1周，對兩組小鼠心功能參數(shù)進行比較，室壁厚度、心腔容積及左心室收縮功能均未發(fā)現(xiàn)明顯差異；術(shù)后2周，兩組小鼠進行心功能檢查，發(fā)現(xiàn)各項參數(shù)均有差異，IGFBP-4組小鼠室間隔厚度及EF值大于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(LVPWd：t=1.799，P=0.041；EF：t=2.004，P=0.024)；而左心室內(nèi)徑及容積則皆小于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，見表1。

表1　兩組小鼠手術(shù)前后心臟功能參數(shù)比較Tab.1　Comparison of cardiac function parameters between two groups of mice before and after operation

與術(shù)前比較，*P<0.05，**P<0.01；與術(shù)后第2周比較，#P<0.05，##P<0.01；與對照組比較，ΔP<0.005

2.3　左心室心肌組織病理學檢查結(jié)果

第2周后處死兩組小鼠并尸解，可發(fā)現(xiàn)兩組小鼠均有心臟增大，部分小鼠有不同程度的血性胸水及心包積液?？梢姽Ｋ绤^(qū)域變性壞死，心肌纖維斷裂破壞，部分形成肌溶灶，心肌間質(zhì)大部分呈充血水腫，鏡下可見大量炎癥細胞浸潤分布，并可見肉芽組織形成。而IGFBP-4組小鼠存活心肌呈現(xiàn)片狀分布，梗死面積明顯少于對照組，部分梗死灶周邊可見新生血管，炎癥細胞浸潤程度也略低于對照組，見圖4，病理結(jié)果與超聲心動圖心功能檢測結(jié)果一致。

2.4　兩組小鼠2周后LVM高頻超聲測量值與尸檢實測值相關(guān)性檢驗

對照組及IGFBP-4組小鼠LVM高頻超聲測量值與尸檢實測值相關(guān)性較好，兩組相關(guān)系數(shù)r值別為0.89與0.93(均P<0.001)，見表2。

表2　兩組LVM高頻超聲測量值與尸檢實測值相關(guān)性

3　討　　論

心肌梗死導(dǎo)致心肌細胞DNA損傷發(fā)生在心肌梗死后1h，而在心肌梗死12h后DNA損傷最嚴重；與此相反的是心肌細胞核內(nèi)β-catenin的數(shù)量在心肌梗死后30min內(nèi)迅速上升，然后在心肌梗死后2h左右回落至基礎(chǔ)狀態(tài)。前期研究[1，5]發(fā)現(xiàn)，IGFBP-4能夠明顯抑制細胞核內(nèi)β-catenin的表達，推測IGFBP-4可能會阻止心肌細胞DNA損傷的發(fā)生。

本研究是通過建立IGFBP-4轉(zhuǎn)基因小鼠與ICR小鼠的心肌梗死模型來比較兩組之間心功能差異的，故對心臟功能參數(shù)的準確評估至關(guān)重要。雖然心導(dǎo)管技術(shù)是評估心功能的最準確檢查，但有創(chuàng)檢查這一點使其運用于動物實驗中受到限制，而小動物高頻超聲能夠通過高頻探頭準確地觀察心臟的心態(tài)運動以及進行功能評估，操作簡便，費用低廉，對于實驗動物數(shù)量多、模型病死率高的動物實驗是最佳的選擇。在本研究中，雖然小鼠心臟體積較小且心率快都增加了形態(tài)學觀察及心功能評估的難度，但采用30MHz的高頻探頭仍可以清楚顯示心內(nèi)結(jié)構(gòu)及血流，主要通過胸骨旁長軸、胸骨旁短軸及心尖四腔切面進行觀察，這三個切面顯示較為穩(wěn)定，心內(nèi)膜顯示清楚，易于測量觀察。室壁厚度、EF值及FS值均通過胸骨旁長軸M型超聲測得，乳頭肌水平短軸切面觀察左心室各節(jié)段運動最為適宜[2-4，6-7]。本研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死模型建立后實驗組IGFBP-4組及對照組小鼠均不同程度出現(xiàn)左心室前壁及前室間隔運動明顯減低，無收縮或出現(xiàn)反向運動，說明兩組小鼠心肌梗死模型建立成功。對照組及IGFBP-4組小鼠心功能與術(shù)前相比均有顯著下降，表現(xiàn)為室壁變薄，心室腔明顯擴大，室壁運動減低，EF及FS值均下降，說明兩組小鼠已發(fā)生心室重構(gòu)[8-9]。而至術(shù)后2周，對照組小鼠的心功能進一步惡化，而IGFBP-4組小鼠左心室腔未繼續(xù)擴大，收縮功能也略好轉(zhuǎn)，說明后者的心室重構(gòu)中斷并可能發(fā)生逆轉(zhuǎn)，而對照組小鼠心室重構(gòu)進展雖能夠暫時代償以保證心臟泵功能，但最終難免惡化為心力衰竭?；谶@些實驗結(jié)果，本研究推測IGFBP-4可能通過在心肌梗死發(fā)生的早期階段下調(diào)β-catenin的表達，抑制Wnt信號通路的活化狀態(tài)，從而參與細胞損傷修復(fù)，并進而阻止心肌梗死更長時間后心肌細胞DNA損傷的發(fā)生。本研究最后通過心肌組織的病理學檢查，對左心室質(zhì)量超聲測量值及實測值之間的相關(guān)性檢驗進行驗證，結(jié)果皆與超聲心動圖一致，都能夠確認高頻超聲心動圖對于實驗?zāi)Ｐ托墓δ茉u估的可行性及可靠性。

圖4　兩組小鼠結(jié)扎手術(shù)前后組織病理學H-E染色檢查與超聲心動圖檢查結(jié)果Fig.4　Histopathological (H-E stain) and echocardiographic findings in two groups before and after operation

高頻超聲心動圖以其高分辨率、簡便無創(chuàng)等優(yōu)點吸引了眾多研究者的關(guān)注，廣泛應(yīng)用于各種實驗動物的心臟功能評定[10-12]。高頻超聲心動圖顯著提高了超聲檢查的分辨率，更清晰地顯示和測量實驗動物心臟的二維結(jié)構(gòu)，且系統(tǒng)提供的分析已經(jīng)接近于臨床所使用的檢查數(shù)據(jù)分析模式，也因此能夠提供更為客觀的超聲成像結(jié)果，是一種適用于早期準確監(jiān)測引起動物模型心臟損害的有效方法[13]。

本研究尚有不足之處。(1) 對于小鼠模型觀察周期較短，對于左前降支結(jié)扎后心功能的長期變化未能作出相應(yīng)的評估；且受到切面限制，未能對除胸骨旁長軸、短軸及心尖四腔以外的切面上室壁運動情況，尤其是梗死節(jié)段心肌局部運動及功能作出評估。(2) 小動物超聲獲取的二維超聲圖像依然不夠清晰，雖然本研究采用的超聲頻率已達30MHz，但是在顯示心臟更加細微結(jié)構(gòu)方面仍感欠缺。期望未來改進小動物超聲圖像的分辨率，獲得更加清晰的圖像，以更加準確地評價小動物心功能變化。

綜上所述，IGFBP-4可能通過在心肌梗死發(fā)生的早期階段下調(diào)β-catenin的表達，抑制Wnt信號通路的活化狀態(tài)，從而參與細胞損傷修復(fù)，并進而阻止心肌梗死更長時間后心肌細胞DNA損傷的發(fā)生。而高頻超聲心動圖安全無創(chuàng)、動態(tài)實時并且可重復(fù)性強，為評價IGFBP-4轉(zhuǎn)基因小鼠心肌梗死模型心臟功能的變化提供了可靠的方法。