王德勝，王曙光，馮麗燕，黃小霞，馬飛

(1東莞市第五人民醫(yī)院，廣東東莞 523981；2中山大學附屬第六醫(yī)院)

原因不明性復發(fā)性流產(URSA)是一種常見的妊娠并發(fā)癥，指連續(xù)發(fā)生2次或2次以上的自然流產，并排除染色體、解剖、內分泌、自身免疫功能異常及生殖道感染等病因的復發(fā)性流產，發(fā)病率為1%～2%[1]。正常妊娠類似于半同種異體移植，攜帶父源HLA抗原的胚胎不被母體免疫系統(tǒng)排斥，有賴于母胎之間建立的免疫耐受。研究證實，CD4+CD25+FoxP3+調節(jié)性T細胞(Treg)對母胎免疫耐受的維持和正常妊娠至關重要[2]。最近研究[3,4]顯示，Treg與URSA的發(fā)生密切相關，與正常孕婦相比，其在URSA患者外周血中的比例明顯降低。然而，關于URSA患者外周血Treg比例在月經周期的不同階段是否會發(fā)生規(guī)律性變化的報道相對較少。因此，本研究將針對URSA患者，在月經周期的月經期、增殖期和分泌期等不同階段分別抽取外周血，應用多色流式細胞術探討Treg變化規(guī)律，以期為URSA發(fā)病機制和淋巴細胞主動免疫治療提供新的理論基礎。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇2015年10月～2016年12月在東莞市第五人民醫(yī)院婦產科門診就診并診斷為URSA的患者35例為研究對象(URSA組)，年齡21～40(30.74±4.41)歲，月經周期(30.77±2.13)d，流產次數(shù)(3.66±0.87)次。URSA診斷標準：①有2次或2次以上的自然流產；②排除生殖道感染與畸形；③夫妻雙方染色體分析均正常，無家族遺傳病史；④女方內分泌及激素檢查結果均正常；⑤無自身免疫性疾??；⑥男方精液常規(guī)正常；⑦封閉抗體陰性。選擇同期在我院工作、至少有1次正常妊娠生育、招募時無懷孕的健康女職工40例為對照組，年齡21～40(31.00±5.13)歲，月經周期(31.33±2.16)d，既往無自然流產、早產、死胎或宮外孕史。兩組年齡、月經周期比較差異無統(tǒng)計學意義，流產次數(shù)比較P<0.01。所有招募者采血時間距離末次流產或正常妊娠生育后至少3個月。本研究獲得受試者的知情同意和東莞市第五人民醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2外周血Treg檢測分別于月經周期的第2～4天(月經期)、11～13天(增殖期)和21～23天(分泌期)，采集受試者外周靜脈血1 mL，應用4色熒光染色和流式細胞術檢測。先進行表面染色(CD3FITC/CD4APC-Cy7/CD25PE-Cy7)，然后進行胞內染色(FoxP3 PerCP-Cy5.5)。染色后重懸于0.5 mL 2%的多聚甲醛中，于24 h內上機檢測，各細胞亞群的變化采用FlowJO7.6軟件分析。

2　結果

URSA組月經期采血時間為月經周期的第(2.71±0.75)天，增殖期采血時間為月經周期的第(13.11±1.11)天，分泌期采血時間為月經周期的第(23.14±1.19)天，對照組分別為第(2.78±0.73)、(13.28±1.28)、(23.35±1.33)天，兩組采血時間比較差異無統(tǒng)計學意義。兩組月經周期外周血Treg水平比較見表1。

表1　兩組月經周期外周血Treg水平比較

注：與同組月經期、分泌期相比，*P<0.01；與對照組增殖期相比，#P<0.01。

3　討論

正常妊娠時，胎兒作為“半同種移植物”，不被擁有正常免疫功能的母體排斥直至足月分娩，這是生殖生物學的一個典型特征[5]。1953年，Medawa第一次提出母體免疫系統(tǒng)與胎兒抗原之間的關系，自此人們從免疫的角度對母胎免疫耐受的認識逐漸加深[6～8]。研究[2,9]證實，Treg對母胎免疫耐受的維持和正常妊娠至關重要。Treg作為輔助性CD4+T細胞的一個亞群，在限制機體免疫系統(tǒng)對抗感染、炎癥和自身免疫反應的發(fā)生中起重要作用[5]。而且，臨床研究[10]也發(fā)現(xiàn)，正常妊娠期間Treg的比例明顯升高，而復發(fā)性流產(RSA)患者則無此現(xiàn)象。RSA指2次或2次以上的自然流產者，在計劃懷孕的婦女中發(fā)生率高達5%[5]。RSA的病因十分復雜，主要包括遺傳因素(包括胚胎自身發(fā)育過程中出現(xiàn)的異常以及遺傳自父母的異常)、解剖因素、內分泌因素、感染因素、免疫功能異常、血栓前狀態(tài)、孕婦的全身性疾病及環(huán)境因素等[11]。近年來，隨著生殖免疫學研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)約半數(shù)的RSA與免疫功能紊亂有關；根據(jù)不同因素導致免疫病理類型的差異，進一步分為自身免疫型RSA和同種免疫型RSA，由于后者仍處于研究階段，又常常被稱為URSA[11]。研究[12,13]顯示URSA患者外周血及蛻膜中Treg顯著降低。

本研究采用多色流式細胞術對URSA患者和健康女性月經周期不同階段外周血Treg比例進行檢測，發(fā)現(xiàn)兩組外周血Treg在月經周期出現(xiàn)了典型的動態(tài)變化，兩組增殖期的細胞比例均為最高。這提示，月經周期的增殖期是受孕及受精卵著床的關鍵時期，升高的Treg通過負調控機體的免疫功能，對母胎免疫耐受的建立可能起到關鍵性作用。進一步分析發(fā)現(xiàn)，在增殖期，URSA組Treg比例較對照組降低。之前有研究[14]發(fā)現(xiàn)，自發(fā)性流產的患者外周血Treg與正常妊娠女性相比無顯著性差異，我們推測這可能樣本的選擇的月經周期的不同時期有關。上述研究外周血采集在月經周期的哪個時期不詳，事實上，本研究中出現(xiàn)明顯差異的是月經周期中的增殖期，在月經期和分泌期也無差異。越來越多的研究[15,16]顯示，RSA患者外周血Treg的比例較正常妊娠女性明顯降低。最近Sereshki等[4]通過對比URSA患者和對照組月經周期的增殖期和分泌期發(fā)現(xiàn)，對照組增殖期Treg的比例較URSA組明顯升高，這與本研究結果相一致。最后，由于本研究僅對月經周期不同階段外周血Treg所占的比例進行了檢測，而其相關的功能性細胞因子如IL-10和表面抑制性受體如CD39、CTLA-4的表達并未進行研究。進一步研究URSA患者外周血Treg的功能及其表面標志在月經周期不同階段是否會出現(xiàn)規(guī)律性變化，對URSA發(fā)病機制及其免疫治療將會起到極大的促進作用。

綜上所述，外周血Treg水平在URSA患者月經周期中呈現(xiàn)典型的動態(tài)變化，且在增殖期URSA患者的比例低于健康女性，免疫功能的紊亂在URSA發(fā)病過程中可能具有重要作用。