張仁忠，朱雯銀，劉吉文，姜睿

(1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州 646000；2邛崍市醫(yī)療中心醫(yī)院；3中國(guó)人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院)

前列腺癌(PCa)是發(fā)達(dá)國(guó)家男性中最常見的惡性腫瘤之一[1]，尋找用于評(píng)估PCa的發(fā)展過(guò)程且具有診斷特征的指標(biāo)對(duì)于PCa有效治療至關(guān)重要。血清前列腺特異抗原(PSA)是PCa臨床篩選和診斷、預(yù)后判斷的重要指標(biāo)，但PSA臨床診斷仍具有一定的局限性，如前列腺增生等疾病等均可引起PSA水平升高[2,3]。微小RNA(miRNA)是指約22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的小的非編碼RNA，被認(rèn)為是細(xì)胞基因表達(dá)的強(qiáng)大調(diào)節(jié)劑，幾乎參與所有的生命活動(dòng)過(guò)程[4]。同時(shí)，miRNA表達(dá)失調(diào)與許多腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展有關(guān)，被認(rèn)為是所有癌癥類型中較為有診斷價(jià)值和預(yù)測(cè)腫瘤預(yù)后的生物標(biāo)志物[5,6]。miRNA-711是一種抑制腫瘤增殖的新型miRNA[7]，其與PCa的關(guān)系尚未見報(bào)道。本研究觀察了PCa患者血清中miRNA-711的水平變化，并探討其意義?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　 資料與方法

1.1臨床資料選擇2015年1月～2017年5月就診于邛崍市醫(yī)療中心醫(yī)院泌尿外科、中國(guó)人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院泌尿外科的PCa患者40例(PCa組)，年齡(64.39±7.87)歲。所有患者未接受放化療治療。按照美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期14例、Ⅱ期5例、Ⅲ期11例、Ⅳ期10例；按照Gleason分級(jí)，8～10分24例、7分7例，2～6分9例。同時(shí)選擇前列腺增生(BPH)患者40例(BPH組)及健康體檢男性對(duì)照者40例(對(duì)照組)，兩組年齡分別為(61.85±5.39)、(57.72±6.20)歲。三組年齡比較具有可比性。本研究對(duì)象已簽署知情同意書并通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2血清miRNA-711檢測(cè)方法采用無(wú)菌抗凝管收集各組靜脈血標(biāo)本4 mL，提前預(yù)冷離心機(jī)4 ℃下3 000 r/min離心15 min，提取上清液2 mL，再次1 500 r/min離心3 min，提取上清無(wú)細(xì)胞液300 μL。用1 mL TRIzol試劑將血清混合,將以上混合液標(biāo)本轉(zhuǎn)移到1.5 mL的EP管中，室溫下放置5 min。然后加入等體積的氯仿，加蓋后劇烈搖晃15 s，在室溫下放置5 min，4 ℃下12 000 g離心15 min。將上層水相RNA轉(zhuǎn)移到另一干凈的EP管中，加入0.5 mL異丙醇，室溫靜置10 min，4 ℃下12 000 g離心10 min。離心后看到絮狀膠樣RNA沉淀。RNA洗滌去上清，加入0.6 mL 75%乙醇洗滌RNA沉淀，4 ℃下7 500 g離心5 min。RNA再溶解去上清，置空氣中5～10 min。用無(wú)RNase水重懸RNA沉淀，用槍頭反復(fù)吹打幾次，55～60 ℃靜置10 min。取2 μL儲(chǔ)存液加入另一個(gè)EP管中，再加入98 μL無(wú)RNase水，離心混勻，以無(wú)RNase水作為空白對(duì)照，測(cè)OD260/280值。OD260/280值在1.8～2.0可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。血清miRNA-711檢測(cè)采用RT-qPCR技術(shù)。采用50 μL體積作為反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)體系中包括5×的反應(yīng)緩沖液10 μL，使用2 μg RNA模板、1 μL的RNA酶抑制劑、1 μL的反轉(zhuǎn)錄酶、4 μL的2.5 nmol/L dNTP Mix，加入去RNA酶水定容至50 μL。在美國(guó)羅氏公司PCR儀器上設(shè)置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序：42 ℃條件下反應(yīng)60 min，70 ℃條件下反應(yīng)10 min。RT-qPCR反應(yīng)體系包括：Bulge-LoopTMmiRNA RT-qPCR Primer Kit、dNTP mix、Taq酶、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、SYBR Green Ⅰ、去RNA酶水(均購(gòu)自HaiGene生物試劑公司)，反應(yīng)條件：95 ℃ 20 s、95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、70 ℃ 5 s，共40個(gè)循環(huán)。Has-miRNA-711引物序列為：5′-GGGACCCTGG-GAGAGATGTAAG-3′。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以U6為內(nèi)參，采用2-ΔCt法計(jì)算miRNA-711水平。

2　結(jié)果

2.1各組血清miRNA-711水平比較PCa組、BPH組、對(duì)照組血清miRNA-711水平分別為15.65±3.97、19.47±3.51、20.53±4.26，PCa組與BPH組、對(duì)照組相比P均<0.05。

2.2血清miRNA-711水平與PCa臨床病理特征的關(guān)系見表1。

表1　　　　血清miRNA-711水平與PCa臨床病理特征的關(guān)系

3　討論

臨床上，采用PSA診斷PCa會(huì)不斷地增加新的PCa病例的數(shù)量，然而關(guān)于篩查PSA是否有效降低PCa的死亡風(fēng)險(xiǎn)尚未達(dá)成共識(shí)[8]。由于PSA診斷PCa特異性較低，因此找出檢測(cè)PCa的特定分子標(biāo)志物可能是加快PCa診斷、預(yù)后和治療的理性方法。miRNA是一組小的非編碼RNA，通過(guò)靶向相應(yīng)的mRNA來(lái)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)[9,10]。許多研究報(bào)道m(xù)iRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展息息相關(guān)，因而與腫瘤相關(guān)的miRNA標(biāo)志物成為了研究熱點(diǎn)[11]。目前研究表明，大部分miRNA與癌癥有密切的關(guān)系，其中有部分miRNA已被證明在PCa中發(fā)揮重要的作用，并且具有一定的評(píng)估預(yù)后的臨床價(jià)值[12～14]。

目前，關(guān)于miRNA-711的報(bào)道較少。miRNA-711在各種不同的病理組織狀況下可表現(xiàn)為不同的作用,如miRNA-711在乳腺癌和皮膚T細(xì)胞淋巴瘤中具有致癌性；在胃癌中是一種腫瘤抑制因子[15,16]；在HPV陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞中被鑒定為一種新型miRNA診斷標(biāo)志物[17]。除了癌癥外，miR-711在外傷性腦損傷、心肌梗死和胰島素抵抗中均具有重要的作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，PCa組血清中miRNA-711水平低于BPH組、對(duì)照組，Ⅲ、Ⅳ期的PCa患者血清miRNA-711水平比Ⅰ、Ⅱ期者低，Gleason病理評(píng)分>7分的PCa患者血清miRNA-711水平比≤7分者低，提示miRNA-711可能參與了腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、增殖、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。通過(guò)本次研究，我們發(fā)現(xiàn)miRNA-711是PCa中一種新型的miRNA，可作為PCa分級(jí)、預(yù)后評(píng)估的監(jiān)測(cè)因子和潛在治療靶點(diǎn)，同時(shí)通過(guò)檢測(cè)血清中的miRNA-711水平能有助于提高PCa早期的輔助診斷率。

綜上可見，PCa患者血清miRNA-711水平降低，miRNA-711可能作為抑癌因子參與了PCa的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程，可能是PCa診斷、預(yù)后評(píng)估的新型生物標(biāo)志物，但其對(duì)PCa具體的機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。