李莉 李剛(通訊作者) 曹紅 舒欣 王萬(wàn)志 胡立立

（1黔西南州人民醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科 貴州 興義 562400）（2中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院感染性疾病科 廣東 廣州 510000）（3黔西南州人民醫(yī)院腫瘤科 貴州 興義 562400）

全球有約3.5億人感染乙肝病毒（hepatitis virus B，HBV）。HBV是一種嗜肝DNA病毒，在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制對(duì)肝細(xì)胞不直接造成損傷[1]。目前認(rèn)為機(jī)體免疫系統(tǒng)針對(duì)病毒及病毒抗原的免疫反應(yīng)在清除病毒的同時(shí)導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷而發(fā)生肝炎。多種細(xì)胞因子在HBV感染后表達(dá)增高、聚集肝組織，誘導(dǎo)多種免疫細(xì)胞分化、成熟、聚集肝組織，導(dǎo)致肝內(nèi)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)活化，引起肝組織損傷，發(fā)生病毒性肝炎[2]。目前IL-32、IL-1β、TNF-α炎癥因子水平與CHB的關(guān)系是研究的熱點(diǎn)[3]。因此本文擬CHB患者肝組織中IL-32與IL-1β、TNF-α細(xì)胞因子相關(guān)性，以了解IL-32在CHB肝損傷發(fā)生中的作用，為以炎性因子為靶點(diǎn)的CHB治療提供依據(jù)。

1.資料與方法

1.1 資料

收集廣州中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院感染科和我院2012年10月—2017年9月明確診斷為CHB的患者，共計(jì)106例，根據(jù)患者肝組織標(biāo)本，分為40例輕度CHB組、30例中度CHB組、36例重度CHB組。收集兩院健康人群的正常肝組織標(biāo)本100例，作為對(duì)照組。CHB組男55例，女51例，平均年齡46.38±13.82歲。對(duì)照組男66例，女34例，平均年齡43.25±15.28歲。兩組性別和年齡比較無(wú)差異。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn)

（1）CHB組確診有乙肝病毒感染，病史大于3月。（2）所有研究對(duì)象臨床資料完整，知情同意。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

（1）腦、肝、腎等重要臟器功能不全者。（2）嚴(yán)重精神障礙、認(rèn)知功能障礙者。

1.4 研究方法

測(cè)定IL-32與IL-1β、TNF-α指標(biāo)：

所有研究對(duì)象納入研究后，抽取早餐空腹肘部靜脈血。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查。（1）用Percoll不連續(xù)密度梯度離心分離肝內(nèi)MNCs：把盛有肝組織的器皿置于冰上，把肝組織剪碎至約1mm3大小，加入預(yù)先制冷的1640培養(yǎng)基（含10% FBS）中懸浮，把組織懸浮液過200目不銹鋼網(wǎng)，用注射器內(nèi)芯輕輕研磨，并加入1640培養(yǎng)基（含10% FBS）沖洗，取濾液約40～45ml轉(zhuǎn)入50ml離心管中，550r/min離心3分鐘，把上清轉(zhuǎn)入另一個(gè)50ml離心管，1500r/min離心10分鐘，棄上清，3ml 40% percoll重懸沉淀，緩慢加至3ml 70% percoll分離液上，2400r/min離心20分鐘，從40%與70%percoll分界面上小心吸取肝內(nèi)MNCs細(xì)胞，然后洗滌，調(diào)整細(xì)胞濃度為106/ml。（2）構(gòu)建IL-32表達(dá)載體及IL-32 siRNA載體A構(gòu)建IL-32表達(dá)載體：提取人全基因組DNA，合成擴(kuò)增IL-32基因片段的引物，PCR擴(kuò)增IL-32基因，雙酶切后連接至pCMV表達(dá)載體；菌落PCR鑒定、酶切鑒定、測(cè)序鑒定。B構(gòu)建IL-32 siRNA載體：在pubmed基因庫(kù)中獲取IL-32編碼序列；利用軟件設(shè)計(jì)針對(duì)IL-32基因序列的siRNA序列；合成siRNA序列并插入pGenesil-1表達(dá)載體；菌落PCR鑒定、酶切鑒定、測(cè)序鑒定。（3）IL-32表達(dá)載體及IL-32 siRNA載體分別轉(zhuǎn)染MNC細(xì)胞，real-time PCR、ELISA分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后TNF-α、IL-8、MIP-2、IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子的表達(dá)水平。

1.5 觀察指標(biāo)

對(duì)比CHB組和對(duì)照組IL-32與IL-1β、TNF-α水平；輕、中、重度CHB患者IL-32與IL-1β、TNF-α水平；CHB患者IL-32與IL-1β、TNF-α的相關(guān)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)

采用SPSS17.0軟件，計(jì)數(shù)資料χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料t檢驗(yàn)或方差分析，P＜0.05為差異有意義。

2.結(jié)果

2.1 CHB組和對(duì)照組IL-32與IL-1β、TNF-α水平

CHB組和對(duì)照組IL-32與IL-1β、TNF-α水平比較有差異（P＜0.05），見表1。

表1 CHB組和對(duì)照組IL-32與IL-1β、TNF-α水平

2.2 輕、中、重度CHB患者IL-32與IL-1β、TNF-α水平

輕、中、重度CHB患者IL-32與IL-1β、TNF-α水平比較有差異（P＜0.05），見表2。

表2 輕、中、重度CHB患者IL-32與IL-1β、TNF-α水平

2.3 CHB患者IL-32與IL-1β、TNF-α的相關(guān)性

IL-32與IL-1β、TNF-α均呈正相關(guān)，相關(guān)性系數(shù)分別為0.652、0.687，比較有差異（P＜0.05）。

3.討論

本次研究發(fā)現(xiàn)CHB組和對(duì)照組IL-32與IL-1β、TNF-α水平比較有差異（P＜0.05），即CHB患者的IL-32、IL-1β及TNF-α水平表達(dá)高于健康人群。有文獻(xiàn)指出HBV編碼的HBx蛋白誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá)IL-32，而且發(fā)現(xiàn)CHB患者肝組織中IL-32表達(dá)增高，且IL-32表達(dá)水平與CHB炎癥程度呈正相關(guān)，因此推測(cè)IL-32在CHB肝損傷發(fā)生中起重要作用。同時(shí)HBV、HCV、Influenza A等多種病原體均可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞及非免疫細(xì)胞表達(dá)IL-32，IL-32通過活化NF-κB和p38 mitogen-activated protein kinase（MAPK）信號(hào)通路誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β細(xì)胞因子表達(dá)，在慢性丙型病毒性肝炎（CHC）肝組織炎癥及纖維化發(fā)生中起重要作用[4]。

本次研究還發(fā)現(xiàn)輕、中、重度CHB患者IL-32與IL-1β、TNF-α水平比較有差異（P＜0.05）。即隨著CHB損傷的加重，會(huì)造成IL-32與IL-1β、TNF-α水平表達(dá)的升高，這可能與IL-32、IL-1β、TNF-α參與CHB肝臟損傷有關(guān)[5]。TNF-a在細(xì)胞免疫和炎癥反應(yīng)中扮演重要的角色[6]。有研究顯示TNF-a可激活單核-巨噬細(xì)胞釋放TNF-a而影響肝臟免疫系統(tǒng)，同時(shí)TNF-a表達(dá)上升后可使大量炎性細(xì)胞粘附于血管內(nèi)皮，促進(jìn)肝臟纖維化[7]。IL-1β為急性期炎癥指標(biāo)，可刺激造血細(xì)胞和T、B細(xì)胞增殖分化，調(diào)節(jié)宿主對(duì)微生物感染的免疫反應(yīng)[8]。IL-1β水平上升后可以可以促進(jìn)粘附分子表達(dá)上升，引起單核細(xì)胞聚集與浸潤(rùn)，促進(jìn)CHB病情的發(fā)展。IL-32是新發(fā)現(xiàn)的促炎癥細(xì)胞因子，肝內(nèi)細(xì)胞因子聚集及活化CHB肝損傷的重要原因。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)CHB患者的病理肝臟組織中IL-32水平為健康人群的1.23倍[9]?；九c本次研究一致。

本次研究發(fā)現(xiàn)輕、中、重度CHB患者IL-32與IL-1β、TNF-α水平比較有差異（P＜0.05），即IL-32表達(dá)的上升會(huì)造成IL-1β、TNF-α表達(dá)升高，之間互為因果，互相惡化。因此本文認(rèn)為CHB患者肝組織中IL-32表達(dá)明顯高于健康人群，IL-1β、TNF-α細(xì)胞因子的過量表達(dá)可能與IL-32有關(guān)。

[1]鄒勇,鄭常龍,楊小安.HBV-ACLF患者外周血和肝臟IL-32的表達(dá)水平與肝損傷的相關(guān)性[J].新醫(yī)學(xué),2018,49(02)：94-98.

[2]曾明曦,康長(zhǎng)明,王瓊芳,等.炎癥因子IL-32、IL-1β、IL-18及EpCAM在肝細(xì)胞肝癌診斷和生存預(yù)測(cè)中的作用[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2017,46(12)：1672-1673.

[3]梁美蓮,陳小燕,張凡,等.IL-32γ活化Akt通路誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞LX-2表達(dá)MMP[J].中華肝臟外科手術(shù)學(xué)電子雜志,2017,6(04)：328-331.

[4]鄒美銀,章幼奕,朱勇根,等.乙肝病毒相關(guān)肝細(xì)胞肝癌與IL-32表達(dá)相關(guān)性研究[J].中華腫瘤防治雜志,2017,24(12)：835-838+844.

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