楊棟霞，馬桂霞

鄭州市第一人民醫(yī)院婦科，鄭州450004

宮頸癌是一種常見的女性惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于乳腺癌[1]。據統(tǒng)計，全球范圍內有超過85%的宮頸癌患者發(fā)生于發(fā)展中國家，治療失敗、復發(fā)率高等是宮頸癌致死的重要原因[2]。腫瘤細胞有著與正常細胞不同的能量代謝方式，盡管在氧氣充足的環(huán)境下仍然以糖酵解為主要代謝途徑，這種代謝方式能夠增加腫瘤細胞的耐受能力，從而促進腫瘤的發(fā)展[3]。NOB1是一種鋅帶蛋白，能夠調控溶酶體的形成和成熟，在核糖體小亞基的合成中發(fā)揮促進作用[4]。NOB1與細胞內基因的轉錄和翻譯有關，在正常癌旁組織中表達水平明顯低于腫瘤組織[5]。有研究表明，NOB1下調后的骨肉瘤細胞、腎透明細胞癌細胞等腫瘤細胞的增殖活力下降，細胞周期紊亂[6-7]。癌細胞的生長需要糖酵解途徑提供能量，對于NOB1在宮頸癌細胞糖酵解及細胞凋亡中的作用尚不明確。本研究主要探討NOB1在宮頸癌細胞糖酵解和凋亡中的作用，為靶向治療宮頸癌提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

宮頸癌細胞HeLa購自中國科學院細胞庫；NOB1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物由上海生工合成；胰蛋白酶、己糖激酶Ⅱ（hexokinaseⅡ，HK-Ⅱ）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性檢測試劑盒均購自美國Sigma公司；Lipofectamine 2000購自美國Thermo公司；兔抗NOB1一抗、兔抗β-連環(huán)蛋白（β-catenin）一抗和兔抗c-myc一抗購自美國Abcam公司；NOB1siRNA、siRNA control均購自美國Roche公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒、cDNA合成試劑盒、qRT-PCR試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉染

宮頸癌細胞用含有胎牛血清總體積10%和1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。將保存在液氮中的細胞取出后，放置于溫度設定為37℃的水浴中，搖動溶解。將細胞轉移到6 cm的培養(yǎng)皿后，加入3 ml的細胞培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。密度達到90%后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化1 min。1500 rpm離心3 min。棄上清，加入1 ml的培養(yǎng)液懸浮細胞，接種到細胞培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。用Lipofectamine 2000將NOB1siRNA、siRNA control轉染至宮頸癌細胞中，記為NOB1siRNA組、siRNA control組，同時以未轉染的細胞為對照組。

1.3 RT-PCR檢測轉染效果

siRNA control組、NOB1siRNA組、對照組細胞培養(yǎng)48 h后，每個6孔板每孔加入1 ml的Trizol裂解細胞，提取細胞總RNA。逆轉錄合成cDNA，進行qRT-PCR，步驟參照瑞士羅氏的FastStart Universal SYBR Green MasterMix說明書。NOB1-正義：5'-GAAAGAACAACGCCCTGGAG-3'，NOB1-反義：5'-CAGCCTTGAGATGACCTAAGC-3'；GAPDH-正義：5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3'，GAPDH-反義：5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'。反應條件：95 ℃，10 s；95 ℃，15 s；60 ℃，30 s；共40個循環(huán)。運用△△Ct法分析相對表達量：以GAPDH為內參基因，取內參和目的基因的Ct值的差值，△Ct=Ct目的－Ct內參，△△Ct=（轉染組目的基因Ct值－轉染組內參基因Ct值）－（對照組目的基因Ct值－對照組內參基因Ct值）。實驗重復3次，取均值。

1.4 細胞凋亡檢測

siRNA control組、NOB1siRNA組、對照組細胞培養(yǎng)48 h后，加入胰蛋白酶消化細胞，收集106個細胞，用冰預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，加入200 μl的結合緩沖液混合后，依次加入5 μl碘化丙啶（propidium iodide，PI）和 5 μl膜聯蛋白 V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）孵育反應10 min。在細胞懸浮液中加入400 μl結合緩沖液，在1 h內用流式細胞儀檢測細胞凋亡。實驗重復3次，取均值。

1.5 HK-Ⅱ和LDH活性檢測

siRNA control組、NOB1siRNA組、對照組細胞培養(yǎng)48 h后，收集各組細胞，用HK-Ⅱ和LDH活性檢測試劑盒檢測細胞中HK-Ⅱ和LDH水平。實驗重復3次，取均值。

1.6 Western blot法檢測NOB 1、 β-catenin和c-myc蛋白表達

siRNA control組、NOB1siRNA組、對照組細胞培養(yǎng)48 h以后，按照蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。用12%分離膠、4%濃縮膠進行電泳，80 V電壓跑膠30 min，將電壓加至120 V，直到蛋白標準品進入分離膠底部邊緣。300 mA轉膜90 min。用5%的胎牛血清白蛋白室溫搖床封閉1 h。TBST洗3次，每次5 min。加入1000倍稀釋的一抗，4℃過夜反應。TBST洗3次，每次5 min。與3000倍稀釋的二抗室溫反應2 h。ECL發(fā)光，曝光，用目的蛋白灰度值與GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白相對表達水平。實驗重復3次，取均值。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟-件對數據進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NOB 1蛋白表達的檢測結果

siRNA control組細胞中NOB1mRNA和蛋白表達水平與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；NOB1siRNA組細胞中NOB1mRNA和蛋白表達水平均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（圖1、表1）

圖1 Western blot法檢測NOB 1蛋白表達情況

表1 siRNAcontr ol組、NOB 1 siRNA組、對照組細胞中NOB 1表達水平的比較（ n= 3，±s）

表1 siRNAcontr ol組、NOB 1 siRNA組、對照組細胞中NOB 1表達水平的比較（ n= 3，±s）

注：*與對照組比較，P＜0.05

組別對照組siRNAcontrol組NOB1 siRNA組F值P值1.00±0.08 0.98±0.12 0.32±0.04*60.161 0.000 0.93±0.09 0.94±0.07 0.25±0.06*84.813 0.000 NOB1 mRNA NOB1蛋白

2.2 細胞凋亡檢測結果

siRNA control組、NOB1siRNA組、對照組細胞凋亡率分別為（12.04±1.14）%、（45.21±4.22）%、（11.25±1.36）%，3組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=161.337，P=0.000）；其中，siRNA control組細胞凋亡率與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；NOB1siRNA組細胞凋亡率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（圖2）

圖2 流式細胞術檢測細胞凋亡情況

2.3 HK-Ⅱ和LDH活性檢測結果

siRNA control組細胞HK-Ⅱ和LDH水平與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；NOB1siRNA組細胞HK-Ⅱ和LDH水平均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 siRNAcontr ol組、NOB 1 siRNA組、對照組細胞HK-Ⅱ、LDH活性的比較（ n= 3，±s）

表2 siRNAcontr ol組、NOB 1 siRNA組、對照組細胞HK-Ⅱ、LDH活性的比較（ n= 3，±s）

注：*與對照組比較，P＜0.05

組別對照組siRNAcontrol組NOB1 siRNA組F值P值HK-Ⅱ（×103U/g）165.37±14.23 158.54±16.35 89.66±10.70*27.014 0.001 LDH（×103U/g）3124.58±286.84 3018.86±256.73 1896.12±142.57*24.753 0.001

2.4 β-catenin和c-myc蛋白表達檢測結果

siRNA control組細胞β-catenin和c-myc水平與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；NOB1siRNA組細胞β-catenin和c-myc水平均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（圖3、表3）

圖3 Western blot法檢測β -catenin和c-myc蛋白表達情況

表3 siRNAcontr ol組、NOB 1 siRNA組、對照組細胞β-catenin和c-myc蛋白表達水平的比較（ n= 3，±s）

表3 siRNAcontr ol組、NOB 1 siRNA組、對照組細胞β-catenin和c-myc蛋白表達水平的比較（ n= 3，±s）

注：*與對照組比較，P＜0.05

組別對照組siRNAcontrol組NOB1 siRNA組F值P值β-catenin 1.15±0.11 1.18±0.13 0.32±0.04*70.069 0.000 c-myc 0.68±0.07 0.69±0.05 0.26±0.04*60.233 0.000

3 討論

NOB1蛋白最初在酵母雙雜交中被發(fā)現，參與核糖體RNA合成[8]。人NOB1基因含有8個內含子和9個外顯子，位于16q22.1染色體上，其編碼的蛋白含有一個PIN結構和一個ZNRD1結構，在蛋白酶體合成中發(fā)揮關鍵作用[9]。NOB1蛋白在卵巢癌組織中的mRNA表達水平高于正常的癌旁組織和良性腫瘤組織，而干擾NOB1表達后的卵巢癌細胞增殖能力和細胞克隆形成能力明顯受到抑制[10]。張向民[11]通過免疫組化的方法檢測NOB1在前列腺癌組織中的表達水平，結果發(fā)現，NOB1在前列腺癌組織中過表達。

細胞能量代謝能夠將有機物轉化為能量，屬于新陳代謝中的一種。正常情況下，葡萄糖可以通過有氧氧化、糖酵解兩種途徑產生能量，當細胞中氧氣充足時以有氧氧化為主，只有在氧氣不足的情況下才會通過糖酵解供能[12]。癌細胞有著與正常細胞不一樣的代謝方式，其無論是在氧氣充足還是氧氣不足的情況下均以糖酵解為主要方式，這種方式稱為“Warburg效應”[13]。HK作為糖酵解過程中的第一個限速酶，在腫瘤組織中過度表達，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14]。HK-Ⅱ是HK的一種亞型，是與腫瘤關系最為密切的HK[15]。LDH能夠將丙酮酸催化形成乳酸，是腫瘤細胞糖酵解中的關鍵調控酶[16]。已經有研究表明，HK-Ⅱ、LDH在結直腸癌等腫瘤中活性異常升高，能夠促進細胞增殖[17-18]。

王宇華等[19]發(fā)現，NOB1在宮頸癌患者中的陽性表達率為71%，而在宮頸炎患者中的表達水平只有7%。楊桂春等[20]發(fā)現NOB1在宮頸癌中的表達水平與患者的生存率、臨床資料等具有相關性，是一種潛在的用于宮頸癌治療和預后的癌基因。本研究結果顯示，NOB1下調后的宮頸癌細胞凋亡率升高，細胞中HK-Ⅱ、LDH活性降低，細胞糖酵解水平降低。本研究結果同樣說明了NOB1是一種癌基因，并且進一步表明了NOB1對宮頸癌細胞糖酵解的調控作用。對于NOB1在其他宮頸癌細胞中的作用是否同本研究一樣需要進一步探討。

Wnt/β-catenin是Wnt的經典信號通路，不僅可以調控正常細胞的增殖，還與腫瘤細胞的多種生物學特性有關[21]。β-catenin 作為 Wnt/β-catenin信號通路的關鍵蛋白，在腫瘤中過度表達，c-myc是Wnt/β-catenin信號通路的下游靶基因，Wnt/βcatenin信號通路激活后促進c-myc的表達[22]。本研究結果顯示，NOB1表達下調后的宮頸癌細胞中β-catenin和c-myc蛋白表達下降，Wnt/β-catenin信號通路激活受到抑制，而對于其具體的調控機制仍然需要驗證。

綜上所述，NOB1下調后宮頸癌細胞凋亡增多，細胞糖酵解途徑調控酶HK-Ⅱ、LDH活性降低，細胞糖酵解水平下降。NOB1是一種癌基因，其作用機制可能與Wnt/β-catenin信號通路有關。本研究結果為探討NOB1在宮頸癌中的作用機制奠定了基礎，為靶向NOB1治療宮頸癌提供了理論基礎。

[1]Scarsbrook A,Vaidyanathan S,Chowdhury F,et al.Efficacy of qualitative response assessment interpretation criteria at 18F-FDG PET-CT for predicting outcome in locally advanced cervical carcinoma treated with chemoradiotherapy[J].Eur J Nucl Med Mol Imaging,2017,44(4):581-588.

[2]Bourgioti C,Chatoupis K,Rodolakis A,et al.Incremental prognostic value of MRI in the staging of early cervical cancer:a prospective study and review of the literature[J].Clin Imaging,2016,40(1):72-78.

[3]張桂蓮,宿穎,張辛燕.山竹醇對人口腔鱗癌細胞糖酵解代謝通路的影響[J].北京口腔醫(yī)學,2017,25(2):66-70.

[4]Liu K,Chen HL,Gu MM,et al.NOB1 expression predicts early response to cisplatin-based chemotherapy in patients with advanced non-small cell lung cancer[J].J Chemother,2016,28(3):225-229.

[5]Ji S,Zhang B,Kong Y,et al.miR-326 Inhibits gastric cancer cell growth through downregulating NOB1[J].Oncol Res,2017,25(6):853-861.

[6]陳炳鵬.NOB1在骨肉瘤中的功能和作用機制研究[D].長春:吉林大學,2014.

[7]Li W,Liu M,Feng Y,et al.Downregulated miR-646 in clear cell renal carcinoma correlated with tumour metastasis by targeting the nin one binding protein(NOB1)[J].Br J Cancer,2014,111(6):1188-1200.

[8]Li Y,Ma C,Qian M,et al.Downregulation of NOB1 suppresses the proliferation and tumor growth of non-small cell lung cancer in vitro and in vivo[J].Oncol Rep,2014,31(3):1271-1276.

[9]Zhang X,Zhang D,Qu F,et al.Knockdown of NOB1 expression inhibits the malignant transformation of human prostate cancer cells[J].Mol Cell Biochem,2014,396(1-2):1-8.

[10]Lin Y,Peng S,Yu H,et al.RNAi-mediated downregulation of NOB1 suppresses the growth and colony-formation ability of human ovarian cancer cells[J].Med Oncol,2012,29(1):311-317.

[11]張向民.NOB1基因在人高侵襲性前列腺癌細胞生物學中的作用研究[D].上海:第二軍醫(yī)大學,2014.

[12]王千千,關泉林,祝秉東.腫瘤細胞糖酵解途徑的抗腫瘤研究[J].國際腫瘤學雜志,2011,38(12):914-916.

[13]Yu Z,Zhao X,Huang L,et al.Proviral insertion in murine lymphomas 2(PIM2)oncogene phosphorylates pyruvate kinase M2(PKM2)and promotes glycolysis in cancer cells[J].J Biol Chem,2013,288(49):35406-35416.

[14]許鶴洋,曾育杰,羅興喜,等.肝再生磷酸酶3參與調控結腸癌細胞有氧糖酵解作用[J].中華實驗外科雜志,2015,32(10):2448-2449.

[15]張德太,左曙蓉,楊文,等.siRNA沉默轉酮醇酶樣基因1下調人宮頸癌細胞HIF-1α表達及糖酵解關鍵酶活性[J].中國病理生理雜志,2014,30(1):72-76.

[16]Xie H,Hanai J,Ren JG,et al.Targeting lactate dehydrogenase--a inhibits tumorigenesis and tumor progression in mouse models of lung cancer and impacts tumor-initiating cells[J].Cell Metab,2014,19(5):795-809.

[17]Graziano F,Ruzzo A,Giacomini E,et al.Glycolysis gene expression analysis and selective metabolic advantage in the clinical progression of colorectal cancer[J].Pharmacogenomics J,2017,17(3):258-264.

[18]Kim JS,Kim YG,Lee HK,et al.Cytokine-induced killer cells hunt individual cancer cells in droves in a mouse model[J].Cancer Immunol Immunother,2017,66(2):193-202.

[19]王宇華,原杰彥,楊賓烈,等.宮頸癌NOB1的表達及其與HPV感染及預后的關系分析[J].臨床和實驗醫(yī)學雜志,2017,16(8):762-765.

[20]楊桂春,于麗波,王玉霞,等.NOB1在宮頸鱗癌中的表達及其臨床意義[J].腫瘤學雜志,2014,20(12):990-993.

[21]李鳳玉,呂洋,劉博,等.腸三葉因子與Wnt/β-Catenin信號通路在結直腸癌中的表達及其與患者預后的關系[J].中國老年學雜志,2015,35(22):6441-6444.

[22]Huang J,Xiao D,Li G,et al.EphA2 promotes epithelialmesenchymal transition through the Wnt/β-catenin pathway in gastric cancer cells[J].Oncogene,2014,33(21):2737-2747.