李清平,張海容
(忻州師范學(xué)院 生化分析技術(shù)研究所,山西 忻州 034000)
黃芪含香豆素、黃酮類化合物、皂甙及微量葉酸和數(shù)種維生素等[1]。味甘,微溫,具有補(bǔ)氣固表,托瘡生肌、利水的功效,主治氣血虛弱、自汗、久瀉脫肛、子宮脫垂、腎炎浮腫、蛋白尿、糖尿病、慢性潰瘍等癥。多糖[2]是天然高分子化合物,存在于各種植物、動物、和微生物組織中,具有許多重要和獨特的生理作用。自由基[3]是常見的生化反應(yīng)的中間態(tài)物質(zhì),與機(jī)體許多功能障礙和疾病的發(fā)生密切相關(guān).當(dāng)人體內(nèi)的自由基產(chǎn)生過度或清除過慢,就會加速機(jī)體的衰老過程,使各種細(xì)胞、器官受到損害,誘發(fā)各種疾病。DPPH·(二苯基苦肼基自由基)[4]在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基,其孤對電子在517nm 附近有強(qiáng)吸收(顯深紫色)。當(dāng)有機(jī)清除劑存在時,孤對電子被配對,吸收消失或減弱,通過測定吸收減弱的程度,可評價自由基清除劑的活性[5]。DPPH·法用以評價天然抗氧化劑抗氧化活性的一種快速(反應(yīng)時間僅需30min 左右)、簡便、靈敏可行的方法。
XA-1型固體樣品粉碎機(jī),金壇市榮華儀器制造有限公司;DZ-1A型真空干燥箱, 天津市泰斯特儀器有限公司;722S 可見分光光度計,上海青華科技儀器有限公司;RE-52旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器,上海安亭電子儀器廠;AB204-N電子分析天平,Mettler―Toledo Group。
無水乙醇,分析純(天津市北原方正試劑廠);95%乙醇,分析純(天津市化學(xué)試劑三廠);DPPH·,分析純(東京化成工業(yè)株式會社);葡萄糖,分析純(新鄉(xiāng)市化學(xué)試劑廠);正丁醇,分析純(天津市化學(xué)試劑三廠);三氯甲烷,分析純(天津市化學(xué)試劑三廠);異丙醇,分析純(天津市北辰方正制藥廠);氫氧化鈉,分析純(天津市北辰方正制藥廠);氯乙酸,分析純(天津市化學(xué)試劑三廠);甲醇, 分析純(天津市化學(xué)試劑三廠);黃芪(忻州惠康藥店)。
1.3.1 黃芪多糖的提取
粗多糖的提取:稱100 g黃芪粉末,用十倍水在水浴中煮沸20 h,過濾后將殘渣再次加十倍水水浴中煮沸20 h,合并兩次濾液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)到200 mL;
純化:用Sevag法去蛋白兩次,至溶液分兩層,取水相,加入800mL的95%乙醇沉淀,真空干燥,得去蛋白黃芪多糖5.012 g,樣品呈褐色;
多糖分級:加熱水將多糖溶解,除去不溶物,上層清液用于分級。乙醇終濃度達(dá)到50%時離心,得沉淀即H1;上清液濃縮,沉淀即H2。
1.3.2 對黃芪多糖H1的化學(xué)修飾
稱取0.3 g多糖(H1)在8 mL異丙醇劇烈攪拌,形成漿狀。室溫下在30min內(nèi)慢慢加入0. 8 mL 30%氫氧化鈉溶液,繼續(xù)攪拌1 h,然后在30min內(nèi)加入0.36 g氯乙酸?;旌弦褐糜?00 mL燒杯中,用濾紙包住,55℃烘箱中放置3.5 h,去除液體,在70%甲醇中邊攪拌邊加入90%乙酸,以中和過量的氫氧化鈉,得甲基化多糖。產(chǎn)物干燥后先用70%甲醇洗滌,再用絕對甲醇洗滌,在60℃干燥。
1.3.3 黃芪多糖對自由基的清除
DPPH·(二苯基苦肼基自由基)在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的長壽命自由基,其孤對電子在517nm附近有強(qiáng)吸收(顯深紫色)。當(dāng)有清除劑存在時,孤對電子被配對,吸收消失或減弱,通過測定吸收減弱的程度,可評價自由基清除劑的活性。DPPH·法用以評價抗氧化劑抗氧化活性是一種快速、簡便、靈敏可行的方法。
原理:一個大分子的穩(wěn)定自由基抗氧化劑預(yù)期作用模式為:
AH + DPPH·→ DPPH-H +A·
依據(jù)DPPH·具有單電子,在517nm處有一強(qiáng)吸收(深紫色),當(dāng)自由基清除劑與其單電子配對使其逐漸消失,其褪色程度與其所接受的電子數(shù)成定量關(guān)系,因而可用分光光度法進(jìn)行定量分析。
步驟:分別取多糖溶液(1.2mg/mL)0.1,0.2,0.4,0.8,1.0,1.5,2.0mL及2×10-4mol·L-1的DPPH·溶液加入同一10mL比色管中,搖勻,30min后用同濃度的提取液作參比,測定吸光度A樣品,同時用無水乙醇作參比,測定2 mL 2×10-4mol/L DPPH液與2 mL無水乙醇混合后溶液的吸光度A對照,根據(jù)下面的公式計算清除率:
A對照—指加入DPPH·的自由基體系的吸光度值;A樣品—指加入不同提取液,DPPH·后自由基體系的吸光度值。
按照實驗方法1.3.1提取黃芪粗多糖: 得去蛋白黃芪多糖5.012 g,樣品呈褐色;熱水將多糖溶解,除去不溶物,上層清液用于分級。乙醇終濃度達(dá)到50%時離心,得沉淀即H1;上清液濃縮,沉淀即H2。再按照實驗方法1.3.2,稱取0.3 g多糖(H1)在8 mL異丙醇劇烈攪拌,形成漿狀。加入0.8 mL 30% 氫氧化鈉溶液,繼續(xù)攪拌1 h加入0.36 g氯乙酸。去除液體,加入90%乙酸,得修飾多糖。產(chǎn)物用70%甲醇洗滌,干燥,即得甲基化多糖0.56 g。
分別測定H1、H2和修飾多糖對自由基的清除率,并以葡萄糖溶液(1.2 mg/mL)的清除率為對照,結(jié)果如圖1。
實驗的結(jié)果表明,三種多糖相同體積時抗自由基能力:H2>甲基化>H1。它們對自由基的清除作用與其濃度呈正相關(guān)性,即隨濃度的逐漸增加,清除率也逐漸增大。在濃度小于0.6 mg/mL時,甲基化多糖與H1有交叉重疊部分,且甲基化多糖略大于H1。H2與甲基化多糖的清除效率小于葡萄糖,這是因為葡萄糖有較強(qiáng)的還原作用。多糖由于在分級純化過程中除去大部分糖肽、蛋白質(zhì)(而這些成分一般具有較強(qiáng)的抗氧化性),故總體清除效果變?nèi)酰嗵瞧淝宄Ч饕话銉?yōu)于維生素C、維生素E及黃酮類化合物,具有對自由基有明顯化學(xué)作用而又不易被氧化的特點。
圖1 H1、H2和甲基化多糖對DPPH自由基的清除率
黃芪多糖一般被用來制成注射液、口服液,但未見黃芪多糖修飾后藥用性能變化的報道。本文通過提取黃芪多糖,以及對提取的多糖純化、分級和修飾來全面研究黃芪多糖的藥用價值。眾所周知,各種中草藥中含有多種抗氧化劑,天然抗氧化劑的應(yīng)用在營養(yǎng)品、化妝品和醫(yī)藥及食品添加劑等方面都取得了可喜的進(jìn)展,展示出廣闊的應(yīng)用前景,隨著自由基和天然抗氧化劑研究的深入,天然抗氧化劑必將為人類的健康作出巨大貢獻(xiàn)。而多糖由于其自身的特點更是倍受關(guān)注,做為一種方便制備的天然抗氧化劑將被作為重要資源而有廣闊前景。
[1]張杰生,張童茜,安 宏.黃芪在心血管疾病治療中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中醫(yī)研究,2012,25(8):78-80.
[2]吳 梅,譚 睿.黃芪多糖研究進(jìn)展[J].川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2013,28(1):17-20.
[3]聶 挺.量子化學(xué)計算研究多酚及多肽清除自由基的構(gòu)效關(guān)系[D].南昌:南昌大學(xué),2016.
[4]李鉉軍,崔勝云.抗壞血酸清除DPPH自由基的作用機(jī)理[J].食品科學(xué),2011(32):86-90.
[5]羅秋水,杜華英,熊建華,等.葛根異黃酮類化合物提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究[J].中國食品學(xué)報,2015,15(2):104-110.