夏盛源，王遠(yuǎn)航，朱蔚云，張 嵐*

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)-中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究所聯(lián)合生命科學(xué)學(xué)院， 廣東 廣州 511436；2.嘉興市疾病預(yù)防控制中心， 浙江 嘉興 314050)

0 引言

人類肺癌大多數(shù)起源于上皮細(xì)胞，鎳化合物和苯并(a)芘(benzoapyrene，Bap)代謝物主要作用于呼吸道上皮細(xì)胞對人形成致癌作用[1]。16HBE細(xì)胞是人的支氣管上皮細(xì)胞，通過不同的化學(xué)致癌物作用，其可發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，常用作肺癌疾病等相關(guān)性研究的實驗?zāi)Ｐ汀Ｈ巳毫餍胁W(xué)調(diào)查和動物實驗已經(jīng)證明，結(jié)晶型硫化鎳(NiS)和反式二氫二醇環(huán)氧苯并芘(anti-7, 8, -dihydrodiol-9, 10-epoxide benzo (a) pyrene，BpDE)具有惡性轉(zhuǎn)化人支氣管上皮細(xì)胞的能力，以致肺癌為主[2]。

自噬是細(xì)胞利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程，被稱為Ⅱ型程序性死亡，是真核細(xì)胞特有的生命現(xiàn)象[3-5]。我們課題組前期利用經(jīng)NiS和反式-BpDE誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞16HBE-T1和16HBE-T2已經(jīng)證明自噬途徑參與了肺上皮細(xì)胞16HBE癌變的過程，但具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究[5]。為了研究自噬途徑在肺上皮細(xì)胞癌變中的作用機(jī)制，我們利用前期建立的細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型，采用熒光顯微鏡動態(tài)細(xì)胞成像系統(tǒng)，通過綠色熒光質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染實驗，在無損傷狀態(tài)下實時觀測活細(xì)胞發(fā)生自噬的動態(tài)變化[6]。

綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFp)在哺乳動物細(xì)胞表達(dá)穩(wěn)定，熒光顯微鏡又容易檢測，因此GFp是常用的標(biāo)記分子[7-11]。LC3是自噬體相關(guān)蛋白，LC3-Ⅱ?qū)τ谧允审w的形成十分必要，有研究表明LC3-Ⅱ的數(shù)量和自噬體的數(shù)量存在一一對應(yīng)的關(guān)系，因而LC3-Ⅱ被普遍認(rèn)為是哺乳動物自噬體的標(biāo)記物[12-14]。 GFp-LC3質(zhì)?？杀磉_(dá)綠色熒光蛋白，將其轉(zhuǎn)染到目的細(xì)胞，表達(dá)穩(wěn)定后就可用熒光顯微鏡進(jìn)行活體細(xì)胞動態(tài)觀察。正常條件下，LC3在胞質(zhì)內(nèi)彌散分布，因此可根據(jù)GFp熒光細(xì)胞的數(shù)量和分布衡量細(xì)胞或組織的自噬行為[15-17]。在觀察GFp-LC3分布的實驗中，我們發(fā)現(xiàn)16HBE的轉(zhuǎn)染效率總比16HBE-T1和16HBE-T2低，這個現(xiàn)象引起了我們的興趣。

為了探究這個現(xiàn)象是否和細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)，我們在三種細(xì)胞中又轉(zhuǎn)染了可表達(dá)無特異性功能的增強(qiáng)型綠色熒光細(xì)胞示蹤標(biāo)記蛋白的熒光質(zhì)粒eGFp，并同時采用多種細(xì)胞密度進(jìn)行轉(zhuǎn)染。通過兩種熒光標(biāo)記，我們可以判斷是否由于質(zhì)粒特異性導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率的差別；多種細(xì)胞密度轉(zhuǎn)染后的結(jié)果可以進(jìn)一步證實細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中細(xì)胞發(fā)生的變化。我們通過一系列的轉(zhuǎn)染實驗，分析其差異性原因，為探討惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的癌變過程提供更直觀的細(xì)胞學(xué)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

人支氣管上皮細(xì)胞系16HBE、結(jié)晶型NiS誘導(dǎo)的16HBE惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞16HBE-T1和反式-BpDE誘導(dǎo)的16HBE惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞16HBE-T2來自廣州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)分子流行病學(xué)實驗室。

1.2 試劑及儀器

胎牛血清(FBS)，RpMI1640培養(yǎng)基(GIBCO)，opti-MEM培養(yǎng)基(GIBCO)，Lipofectamine3000 Reagent(GIBCO)，GFp-LC3和eGFp質(zhì)粒(來自于廣州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)實驗室)，熒光顯微鏡IncuCyte Zoom長時間動態(tài)細(xì)胞成像分析系統(tǒng)(Essen Bioscience)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

16HBE、16HBE-T1和16HBE-T2三種細(xì)胞分別置于用10%FBS、100 U/mL霉素、100 mg/mL鏈霉素和RpMI1640培養(yǎng)基配制的完全培養(yǎng)液中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱。每天換液，2-3天傳代一次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

1.4.1 GFp-LC3質(zhì)粒

將三種細(xì)胞接種于96孔板中，設(shè)置50%、75%和100%的細(xì)胞密度，每一種細(xì)胞按每一個密度接種兩個副孔，每一孔加入完全培養(yǎng)液100 μL放入37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至相應(yīng)密度。轉(zhuǎn)染時，以一種細(xì)胞為例，去除每孔細(xì)胞培養(yǎng)液，加入100 μL opti-MEM培養(yǎng)基后放回培養(yǎng)箱待用。取一Epp管加入opti-MEM培養(yǎng)基40 μL和Lipofectamine3000試劑8 μL，混勻，配成A液。另取一Epp管加入opti-MEM培養(yǎng)基40 μL，質(zhì)粒DNA 1.2 μg和p3000試劑4 μL，混勻，配成B液。將AB液充分混勻，室溫靜置10-15 min。將制備的DNA-脂質(zhì)體混合液平均加入每一孔待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，放回培養(yǎng)箱孵育6-8 h后替換為完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12-36 h收獲細(xì)胞[18]。

1.4.2 eGFp質(zhì)粒

和上述操作一致，將eGFp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至三種細(xì)胞中。共得到兩個分別轉(zhuǎn)染了不同質(zhì)粒的96孔板。

1.5 熒光顯微鏡觀察

GFp-LC3和eGFp質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染后12 h即開始在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)[19]。采用熒光顯微鏡觀察活體細(xì)胞，由于GFp為綠色熒光，顯微參數(shù)為480 nm激發(fā)波長，320 nm發(fā)射波長[20]。每一孔細(xì)胞拍攝4個視野，最后觀察比較其熒光細(xì)胞數(shù)量差異。

2 結(jié)果

2.1 用GFp-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，16HBE細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率比16HBE-T1和16HBE-T2低

在GpF-LC3的轉(zhuǎn)染實驗中，細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)染效果呈現(xiàn)差異。如圖1所示，通過比較三種轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞綠色熒光分布均勻、密度大，而16HBE的熒光細(xì)胞數(shù)量明顯低于16HBE-T1和16HBE-T2。實驗結(jié)果說明正常細(xì)胞16HBE轉(zhuǎn)染GFp-LC3的效率明顯比惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞16HBE-T1和16HBE-T2低。

圖1 細(xì)胞密度達(dá)100% 時GFp-LC3的轉(zhuǎn)染熒光圖和透視圖Fig.1 Transfection fluoroscopy and scenograph of cell which is transferred with GFp-LC3 when the cell abundance is 100%

圖2 細(xì)胞密度達(dá)100% 時eGFp的轉(zhuǎn)染熒光圖和透視圖Fig.2 Transfection fluoroscopy and scenograph of cell which is transferred with eGFp when the cell abundance is 100%

2.2 用eGFp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，16HBE細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率比16HBE-T1和16HBE-T2低

為了探討三種細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的差別是否因為GFp-LC3質(zhì)粒的特異性而造成的，我們還轉(zhuǎn)染了另一種質(zhì)粒eGFp做比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如圖2所示，16HBE的熒光細(xì)胞數(shù)量仍然明顯低于16HBE-T1和16HBE-T2。此實驗結(jié)果說明，正常細(xì)胞16HBE轉(zhuǎn)染eGFp質(zhì)粒的效率低于惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞16HBE-T1和16HBE-T2；轉(zhuǎn)染質(zhì)粒種類的差異不是造成這三種細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率差異的原因。

2.3 不同細(xì)胞密度的轉(zhuǎn)染實驗

由于有些細(xì)胞在不同密度下的轉(zhuǎn)染效率差別較大，因此為了探究造成三種細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的差異是否由于轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度的原因，我們又設(shè)置了另外兩個細(xì)胞密度的轉(zhuǎn)染實驗。從實驗結(jié)果來看，如圖1、圖3和圖 4，圖2、圖5和圖6所示，不僅細(xì)胞與細(xì)胞之間，每一種細(xì)胞在不同細(xì)胞密度時的轉(zhuǎn)染效率也是有差異的。橫向比較在50%、75%和100%的細(xì)胞密度的轉(zhuǎn)染效率，我們發(fā)現(xiàn)每一種細(xì)胞均在細(xì)胞密度大概為75%時的轉(zhuǎn)染效率是最高的。但與此同時，16HBE的熒光細(xì)胞數(shù)量都是少于16HBE-T1和16HBE-T1。因此，該實驗結(jié)果說明細(xì)胞密度并不是造成三種細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率差異的原因。

圖3 細(xì)胞密度達(dá)50% 時GFp-LC3的轉(zhuǎn)染熒光圖和透視圖Fig.3 Transfection fluoroscopy and scenograph of cell which is transferred with eGFp when the cell abundance is 50%

圖4 細(xì)胞密度達(dá)75% 時GFp-LC3的轉(zhuǎn)染熒光圖和透視圖Fig.4 Transfection fluoroscopy and scenograph of cell which is transferred with GFp-LC3 when the cell abundance is 75%

圖5 細(xì)胞密度達(dá)50%時eGFp的轉(zhuǎn)染熒光圖和透視圖Fig.5 Transfection fluoroscopy and scenograph of cell which is transferred with eGFp when the cell abundance is 50%

圖6 細(xì)胞密度達(dá)75%時eGFp的轉(zhuǎn)染熒光圖和透視圖Fig.6 Transfection fluoroscopy and scenograph of cell which is transferred with eGFp when the cell abundance is 75%

3 討論

細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗?zāi)壳霸谘芯炕蚬δ?、調(diào)控基因表達(dá)和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學(xué)實驗中應(yīng)用非常廣泛，是實驗室中很常用和有效的實驗研究方法。陽離子脂質(zhì)體是目前轉(zhuǎn)染效率最高，且細(xì)胞毒性最小的非病毒基因載體之一。其轉(zhuǎn)染效率與脂質(zhì)體成成份、脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA的比例、細(xì)胞狀態(tài)、轉(zhuǎn)染時間以及靶細(xì)胞的選擇性作用有關(guān)[21]。

目前，研究自噬的定量分析方法多使用GFp-LC3法，即通過轉(zhuǎn)染可表達(dá)GFp-LC3融合蛋白的質(zhì)粒，使LC3攜帶有綠色熒光，從而可通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)LC3的定位和分布[22]。因此，我們想通過熒光蛋白質(zhì)粒的瞬時轉(zhuǎn)染來觀察細(xì)胞自噬的情況。在此過程中，我們意外發(fā)現(xiàn)了正常細(xì)胞和惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞在平行條件下的轉(zhuǎn)染效率差異，由此進(jìn)行了兩組轉(zhuǎn)染實驗。eGFp增強(qiáng)型綠色熒光蛋白是一種優(yōu)化的突變型綠色熒光蛋白，其熒光比野生型強(qiáng)35倍，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、高效表達(dá)、無種系依賴性等特點，更適用于細(xì)胞基因表達(dá)和蛋白定位檢測及細(xì)胞示蹤標(biāo)記[23]。在利用GFp-LC3和eGFp質(zhì)粒分別對三種細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染的實驗中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是GFp-LC3還是eGFp，正常細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率都低于惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞，這就排除了質(zhì)粒本身造成此差異的原因。為此，我們還嘗試比較了在多種細(xì)胞密度下，各種細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率是否還存在差異性。實驗結(jié)果證實在不同的細(xì)胞密度下，正常細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率仍然低于惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在利用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染正常細(xì)胞和惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的實驗中，質(zhì)粒的種類差異和轉(zhuǎn)染時的細(xì)胞密度都不是造成它們轉(zhuǎn)染效率差異性的原因。為此，我們猜測是由于惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞在癌變過程中發(fā)生了細(xì)胞膜通透性的改變，從而導(dǎo)致了在轉(zhuǎn)染過程中，細(xì)胞吸收外源質(zhì)粒的程度不一樣。但是要明確細(xì)胞膜通透性影響轉(zhuǎn)染效率的具體作用機(jī)制，需要我們進(jìn)一步的研究。

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