靳曉瑞，吳 意，廖旻晶，邱義蘭，唐 娜，曾林秀，王 平，郭向榮*，劉如石*

(湖南師范大學(xué)， a.醫(yī)學(xué)院； b.第一附屬醫(yī)院； c.生命科學(xué)學(xué)院， 湖南 長(zhǎng)沙 410013)

甲狀腺是人體最大的內(nèi)分泌腺，在機(jī)體中承擔(dān)重要作用。分化型甲狀腺癌(differentiated thyroid cancer，DTC)是內(nèi)分泌系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)逐年上升[1,2]。80%-90%的DTC患者通過(guò)甲狀腺全切或者近全切手術(shù)、131I治療和促甲狀腺激素抑制可獲得長(zhǎng)期生存[3]。DTC患者約占甲狀腺癌患者的90%，在初始治療后10年內(nèi)DTC腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較高[4]。DTC患者預(yù)后總體較好，然而術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率可達(dá)7%-30%[5]，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量及預(yù)后[6]。因此，DTC的術(shù)后隨訪(fǎng)至關(guān)重要。除影像學(xué)檢查外，臨床醫(yī)生還要通過(guò)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)DTC腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)行早期干預(yù)和治療[3]。由于Tg僅由良性甲狀腺細(xì)胞或分化的惡性甲狀腺細(xì)胞分泌，當(dāng)DTC患者接受甲狀腺全切或者近全切手術(shù)、131I治療后，DTC細(xì)胞釋放的Tg是血清Tg的唯一來(lái)源[7]。因此，Tg是分化型甲狀腺癌治療后隨訪(fǎng)的一個(gè)很好的腫瘤標(biāo)志物[7-10]。血清Tg的測(cè)定有助于DTC患者的預(yù)后判斷和監(jiān)測(cè)治療效果[11]。甲狀腺球蛋白在臨床上主要用于監(jiān)測(cè)甲狀腺全切或者近全切手術(shù)、131I治療后是否有甲狀腺組織的殘留和是否復(fù)發(fā)[9-11]。臨床上對(duì)DTC患者的隨訪(fǎng)發(fā)現(xiàn)，血清Tg含量的測(cè)定對(duì)于診斷DTC患者腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的靈敏度為88%-97%，特異性為100%[12]。

甲狀腺球蛋白是由甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞分泌的一種660 kD糖蛋白二聚體，由兩個(gè)相同的330 kD單體經(jīng)二硫鍵連接構(gòu)成，其主要生物學(xué)作用是促進(jìn)甲狀腺激素的碘化合成和合成后的存儲(chǔ)。Tg基因位于人染色體8q24·2-8q24·3，基因組DNA由300 kb組成，編碼2 767個(gè)氨基酸[13]。Tg主要在甲狀腺濾泡細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，經(jīng)高爾基體加工后被分泌到濾泡腔，是濾泡腔內(nèi)膠質(zhì)的主要組成部分[2]。Tg進(jìn)行大量修飾，包括糖基化、碘化和聚合，導(dǎo)致它在膠質(zhì)中顯著的異質(zhì)性[14]。每個(gè)Tg約有2個(gè)甲狀腺素(T4)和0.5個(gè)三碘甲腺原氨酸(T3)分子，儲(chǔ)存在濾泡腔中[15]。在正常情況下，只有極微量的Tg進(jìn)入血液循環(huán)。由于Tg僅由良性甲狀腺細(xì)胞或分化的惡性甲狀腺細(xì)胞分泌，因此在分化型甲狀腺癌中，Tg升高多為腫瘤組織自身釋放所致。甲狀腺切除術(shù)后血清Tg水平仍較高，常提示腫瘤可能殘余或轉(zhuǎn)移[1,16]，對(duì)分化型甲狀腺癌的治療監(jiān)測(cè)有重要臨床意義。本課題的開(kāi)展，將有助于今后國(guó)內(nèi)自主制備抗人甲狀腺球蛋白抗體，有效的降低了成本，具有重要的社會(huì)與經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞株

BALB/c小鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；小鼠骨髓瘤細(xì)胞系Sp2/0由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑

天然人源甲狀腺球蛋白(Tg)購(gòu)自德國(guó)DIARECT公司；HRp-羊抗鼠二抗由廈門(mén)大學(xué)夏寧邵教授惠贈(zèng)；蛋白質(zhì)G親和層析柱購(gòu)自上海生工生物工程公司；蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Thermo公司；BCA蛋白定量 試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；HT和HAT以及弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 天然Tg蛋白動(dòng)物免疫

將Tg蛋白用pBS緩沖液(137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HpO4，2 mmol/L KH2pO4，pH 7.45)溶解并稀釋至濃度為0.5 g/L，按1∶1(v/v)加入弗氏完全佐劑充分乳化。取5只8周齡BALB/c雌鼠做好標(biāo)記，采用皮下多點(diǎn)注射免疫的方法，以每只小鼠100 μg的劑量進(jìn)行初次免疫；第3周，將蛋白質(zhì)溶液和弗式不完全佐劑按1∶1(v/v)混勻充分乳化，以同樣劑量進(jìn)行加強(qiáng)免疫。每間隔14 d進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，一共進(jìn)行三次免疫。具體免疫流程如表 1。

在每次免疫的前 1 d 收集小鼠血清進(jìn)行間接 ELISA，檢測(cè)小鼠血清中抗甲狀腺球蛋白抗體效價(jià)。

1.2.2 間接ELISA檢測(cè)小鼠免疫效價(jià)

Tg蛋白用pBS緩沖液(pH7.45)稀釋至濃度為1 μg/mL，包被酶標(biāo)板，每孔100 μL，4 ℃包被過(guò)夜；洗板1次，在吸水紙上扣干。加入封閉液200 μL。37 ℃封閉2 h；洗板5次，在吸水紙上扣干。加入梯度稀釋的小鼠血清，每孔100 μL，37 ℃孵育30 min；洗板5次，在吸水紙上扣干。加入按1∶5 000稀釋的酶標(biāo)二抗GAM-IgG-HRp，每孔100 μL，37 ℃孵育30 min；洗板5次，在吸水紙上扣干。加入TMB底物顯色劑，每孔100 μL，37 ℃避光反應(yīng)10 min。最后加入1 mol/L的H2SO4終止顯色反應(yīng)，每孔50 μL。酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm進(jìn)行檢測(cè)。

表1 小鼠的抗原免疫程序

Tab.1 Antigen immunization program in mice

免疫周期Immunizingperiod天數(shù)Days/d佐劑Adjuvants免疫劑量Immunizingdose/μg免疫方式Immunemethod一免二免三免沖擊免疫0142846弗氏完全佐劑弗氏不完全佐劑弗氏不完全佐劑無(wú)100100100100多點(diǎn)皮下注射多點(diǎn)皮下注射多點(diǎn)皮下注射腹腔注射

1.2.3 細(xì)胞融合、陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞篩選與亞克隆及亞型鑒定

選取血清效價(jià)最高的小鼠，在融合前4 d腹腔注射100 μg抗原進(jìn)行沖擊免疫。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0與免疫后的小鼠脾臟細(xì)胞分別用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基洗滌3次后，經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)后，以1∶5 ～ 1∶10混合，1 000 g離心10 min。離心后，將上清完全倒干凈，將管底的細(xì)胞沉淀振動(dòng)打散。在37 ℃水浴中，一邊旋轉(zhuǎn)輕輕搖動(dòng)離心管，一邊向混合細(xì)胞中逐滴加入1 mL 37 ℃預(yù)熱的50% pEG 1 500溶液。隨后加入預(yù)熱的20 mL 10%FBS-DMEM完全培養(yǎng)基終止pEG作用。最后加入20% FBS-HAT-DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并混勻。將混勻后的重懸細(xì)胞均勻接種于96孔板中，置于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天跟蹤觀察。融合后7～10 d用10% FBS-HT-DMEM培養(yǎng)基換液。當(dāng)克隆長(zhǎng)至孔底面積的1/3～1/2時(shí)，用間接ELISA方法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞上清抗體效價(jià)。通過(guò)有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性值高且細(xì)胞集落數(shù)目少的孔進(jìn)行亞克隆。經(jīng)過(guò)4次亞克隆后，即得到能穩(wěn)定分泌特異性抗甲狀腺球蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株，然后轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中擴(kuò)大培養(yǎng)，再取細(xì)胞上清進(jìn)行亞型鑒定。

1.2.4 單克隆抗體的亞型鑒定

Tg蛋白用pBS緩沖液(pH7.45)稀釋至濃度為1 μg/mL，包被酶標(biāo)板，每孔100 μL，4 ℃ 包被過(guò)夜或37 ℃ 2 h；洗板1次，在吸水紙上扣干。加入封閉液200 μL，37 ℃封閉2 h；洗板5次，在吸水紙上扣干。加入雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基上清，每孔100 μL，37 ℃孵育30 min；洗板5次，在吸水紙上扣干。加入按1∶5 000稀釋的酶標(biāo)二抗(羊抗鼠IgG1、羊抗鼠IgG2a、羊抗鼠IgG2b、羊抗鼠IgG3、羊抗鼠IgM和羊抗鼠IgG)，每孔100 μL，37 ℃孵育30 min；洗板5次，在吸水紙上扣干。加入TMB底物顯色劑，每孔100 μL，37 ℃避光反應(yīng)10 min。最后加入1 mol/L的H2SO4終止顯色反應(yīng)，每孔50 μL。酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 單克隆抗體的純化

在接種雜交瘤細(xì)胞前1周，給8周齡BALB/c雄鼠腹腔注射0.5 mL液體石蠟。收集生長(zhǎng)良好的雜交瘤細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)細(xì)胞/mL，給每只小鼠腹腔注射0.5 mL細(xì)胞懸液。7～12 d后，待小鼠腹部明顯膨大，抽取腹水。3 000 g離心10 min，棄去上層油脂，吸取淡黃色腹水，-20℃保存?zhèn)溆?。將采集好的腹水緩慢加入等體積的飽和硫酸銨溶液，12 000 g離心10 min，沉淀用一定體積的pBS緩沖液(pH 7.45)溶解。12 000 g 4 ℃離心10 min，收集上清至透析袋中，隨后將其透析平衡至20倍體積的結(jié)合緩沖液(0.15 mol/L NaCl，20 mmol/L Na2HpO4，pH 7.4)中以除去高濃度的離子。透析后的單克隆抗體粗品進(jìn)行蛋白質(zhì)G親和層析。加入5 mL結(jié)合緩沖液預(yù)先平和蛋白質(zhì)G親和柱，上樣透析后的單克隆抗體粗制品1 mL，控制流速為1 mL/min，用25 mL結(jié)合緩沖液淋洗，隨后用10 mL洗脫緩沖液(0.1 mol/L甘氨酸，pH 3.0)洗脫，收集親和層析純化后的抗體裝于透析袋透析平衡至pBS緩沖液(pH 7.45)中。將小鼠原腹水與純化后的抗體經(jīng)SDS-pAGE電泳。

1.2.6 純化后抗體的效價(jià)檢測(cè)

將純化后的抗體稀釋至初始濃度為1 mg/mL，通過(guò)建立的間接ELISA檢測(cè)方法對(duì)7株純化后抗體進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)。

1.2.7 單克隆抗體的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記

稱(chēng)取5 mg辣根過(guò)氧化物酶粉末溶解于0.5 mL雙蒸水中，加入新鮮配制的0.06 mol/L NaIO4水溶液0.5 mL，混勻，4 ℃放置30 min。加入0.16 mol/L 乙二醇水溶液0.5 mL，室溫放置30 min。加入含5 mg純化抗體的水溶液1 mL，混勻，并裝入透析袋，放入碳酸鹽緩沖液(0.03 mol/L NaHCO3，0.07 mol/L Na2CO3，pH 9.6)攪拌透析，4 ℃放置6 h(或過(guò)夜)，使之結(jié)合。加入新配的5 g/L NaBH4溶液0.2 mL，混勻，再4 ℃放置2 h。將上述溶液在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，混勻，4 ℃放置30 min，離心后去上清，沉淀用50%甘油重懸。一般5 mg蛋白用1 mL 50%甘油重懸。上述所得溶液即為酶結(jié)合物，分裝后-20 ℃保存。

1.2.8 間接ELISA法測(cè)定HRp標(biāo)記抗體效率

Tg蛋白用pBS緩沖液(pH7.45)稀釋至濃度為1 μg/mL，作為抗原包被酶標(biāo)板，每孔100 μL，4 ℃包被過(guò)夜或37 ℃ 2 h；洗板1次，在吸水紙上扣干。加入封閉液200 μL，37 ℃封閉2 h；洗板5次，在吸水紙上扣干。加入按1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000稀釋的HRp標(biāo)記的抗體，每孔100 μL，37 ℃孵育30 min；洗板5次，在吸水紙上扣干。加入TMB底物顯色劑，每孔100 μL，37 ℃避光反應(yīng)10 min。最后加入1 mol/L的H2SO4終止顯色反應(yīng)，每孔50 μL,酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm進(jìn)行檢測(cè)。

根據(jù)生命周期理論，企業(yè)在發(fā)展過(guò)程中所處的階段不同，在并購(gòu)過(guò)程中，雙方企業(yè)所處的經(jīng)濟(jì)環(huán)境和稅收政策也會(huì)不同，為了制定出更加適應(yīng)雙方具體情況的籌劃方案，需要使得稅收籌劃方案具有一定的靈活性，可以根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行及時(shí)的調(diào)整，降低風(fēng)險(xiǎn)。

1.2.9 雙抗體夾心ELISA法對(duì)不同抗體進(jìn)行配對(duì)

捕獲抗體用碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)稀釋至濃度為10 μg/mL，包被酶標(biāo)板，每孔100 μL，4 ℃包被過(guò)夜；洗板1次，在吸水紙上扣干。加入封閉液200 μL，37 ℃封閉2 h；洗板5次，在吸水紙上扣干。加入1 μg/mL Tg蛋白作為抗原，37 ℃孵育30 min；洗板5次，在吸水紙上扣干。加入按1∶5 000 稀釋的HRp標(biāo)記的檢測(cè)抗體，每孔100 μL，37 ℃孵育30 min。洗板5次，在吸水紙上扣干。加入TMB底物顯色劑，每孔100 μL，37 ℃避光反應(yīng)10 min。最后加入1 mol/L 的H2SO4終止顯色反應(yīng)，每孔50 μL。酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.10 雙抗體夾心法的建立

1.2.10.1 雙抗體夾心法的基本步驟

捕獲抗體用碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)稀釋至濃度為10 μg/mL，包被酶標(biāo)板，每孔100 μL，4 ℃包被過(guò)夜； 洗板1次，扣干。加入封閉液200 μL，37 ℃封閉2 h；洗板5次，扣干。加入待測(cè)樣品、陰性對(duì)照樣品，每孔100 μL，37 ℃孵育30 min。洗板5次，扣干。加入HRp標(biāo)記的檢測(cè)抗體，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h。洗板5次，扣干。加入TMB底物顯色劑，每孔100 μL，37 ℃避光反應(yīng)10 min。最后加入1 mol/L的H2SO4終止顯色反應(yīng)，每孔50 μL。酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.10.2 捕獲抗體的包被濃度和檢測(cè)抗體的工作濃度的優(yōu)化

按照棋盤(pán)滴定法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，確定捕獲抗體的包被濃度和檢測(cè)抗體的工作濃度。將捕獲抗體5F11按20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL、1.25 μg/mL的濃度依次包被酶標(biāo)板。檢測(cè)抗體12H8按1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000的比例進(jìn)行稀釋。其他步驟同雙抗體夾心法的基本步驟。

1.2.10.3 抗體夾心ELISA法檢測(cè)靈敏度

以抗甲狀腺球蛋白抗體5F11為捕獲抗體10 μg/mL，包被酶標(biāo)板，每孔100 μL，4 ℃包被過(guò)夜；洗板1次，在吸水紙上扣干。加入封閉液200 μL，37 ℃封閉2 h；洗板5次，在吸水紙上扣干。分別加入Tg蛋白濃度為1 μg/mL、100 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL、0.1 ng/mL，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h；洗板5次，在吸水紙上扣干。加入按1∶5 000 稀釋的HRp標(biāo)記抗甲狀腺球蛋白抗體12H8，每孔100 μL，37 ℃孵育30 min；洗板5次，在吸水紙上扣干。加入TMB底物顯色劑，每孔100 μL，37 ℃避光反應(yīng)10 min。最后加入1 mol/L的H2SO4終止顯色反應(yīng)，每孔50 μL，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.10.4 雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)臨床血清樣本

用確定的捕獲抗體和HRp標(biāo)記的檢測(cè)抗體對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品及臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)品是醫(yī)院用甲狀腺〗球蛋白檢測(cè)試劑盒中定標(biāo)液，稀釋至濃度為500 ng/mL、250 ng/mL、125 ng/mL、62.5 ng/mL、31.25 ng/mL、15.63 ng/mL、7.81 ng/mL、3.91 ng/mL、1.95 ng/mL、0.98 ng/mL。應(yīng)用雙抗夾心ELISA法檢測(cè)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，再將臨床樣本檢測(cè)OD值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中，求檢測(cè)值。將所求的檢測(cè)值與醫(yī)院中的臨床值進(jìn)行對(duì)比。臨床血清樣本于湖南省省腫瘤醫(yī)院收集，該樣本已用羅氏甲狀腺球蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，該檢測(cè)值為臨床值。比較檢測(cè)值與臨床值之間的差異，并對(duì)檢測(cè)值與醫(yī)院臨床值相關(guān)性進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)配對(duì)抗體的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 間接ELISA小鼠免疫效價(jià)

通過(guò)間接ELISA檢測(cè)免疫小鼠血清抗體效價(jià)，陰性對(duì)照為未免疫小鼠血清，以2.1倍陰性值設(shè)定為臨界值來(lái)判定是否為陽(yáng)性值。小鼠在初次免疫后體內(nèi)抗體水平較低，在第二次和第三次免疫后可以發(fā)現(xiàn)血清陽(yáng)性值明顯上升(圖1)，說(shuō)明Tg能在小鼠體內(nèi)引起一定的免疫反應(yīng)，作為抗原具有良好的免疫原性。在第三次免疫之后14 d，取血分離血清，倍比稀釋后用間接ELISA檢測(cè)小鼠血清中抗體效價(jià)。結(jié)果如表2所示，4只小鼠效價(jià)均達(dá) 1∶400 000以上，達(dá)到細(xì)胞融合要求，可對(duì)小鼠進(jìn)行沖擊免疫后進(jìn)行細(xì)胞融合。

圖1 Tg免疫小鼠后，間接 ELISA 檢測(cè)小鼠血清中抗體效價(jià)Fig.1 Antibody titers of mice detected by indirect ELISA after immunonized with Tg protein

表2 第三次免疫后小鼠血清的效價(jià)

Tab.2 Antibody titers of serum in mice after the third immunization

小鼠編號(hào)Nameofmouse小鼠血清稀釋度Dilutionratioofseruminmice1：1001：10001：100001：1000001：2000001：4000001號(hào)小鼠2號(hào)小鼠3號(hào)小鼠4號(hào)小鼠陰性組小鼠2．0272．1502．0652．0940．0132．1022．1602．0732．0980．0202．1042．1652．0882．1130．0192．1701．7201．6131．9220．0831．8241．2951．0661．3380．0651．3470．7450．5430．6890．067

2.2 細(xì)胞融合、陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞篩選與亞克隆及亞型鑒定

細(xì)胞融合10 d后，12塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的1 152個(gè)培養(yǎng)孔中有335個(gè)孔中長(zhǎng)有葡萄樣雜交瘤細(xì)胞集落。用間接ELISA方法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞上清抗Tg抗體效價(jià)，其中7孔為陽(yáng)性。這7個(gè)孔通過(guò)有限稀釋法分別進(jìn)行亞克隆。經(jīng)過(guò)4輪亞克隆，獲得了7株能夠穩(wěn)定分泌抗甲狀腺球蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1B5、5E1、5F11、5F12、6E5、9E3、12H8。

取細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行抗體亞型鑒定。以2.1倍陰性值設(shè)定為臨界值來(lái)判定是否為陽(yáng)性值。高于2.1倍陰性值 即為陽(yáng)性值。亞型鑒定結(jié)果顯示：除9E3細(xì)胞株抗體亞型為IgG2a外，其他6株細(xì)胞株亞型均為IgG1(圖2)。

圖2 單克隆抗體亞型鑒定Fig.2 Subtype identification of anti-Tg monoclonal antibodies

2.3 單克隆抗體的純化與鑒定

注射雜交瘤細(xì)胞7～12 d小鼠腹水可形成，抽取腹水。腹水首先經(jīng)50%硫酸銨沉淀初步純化，然后用蛋白質(zhì)G親和層析柱純化。以還原型的SDS-pAGE電泳分析純化后的抗體，分離膠濃度為12%。在β-巰基乙醇的作用下，免疫球蛋白中的二硫鍵被破壞，重鏈與輕鏈分開(kāi)。在還原型的SDS-pAGE電泳中，可見(jiàn)兩條明顯的條帶(圖3，lane 3)，重鏈約相對(duì)分子質(zhì)量約為50 kD、輕鏈相對(duì)分子質(zhì)量約為25 kD。與原腹水，純化后的單抗沒(méi)有其他明顯的雜帶，具有較高的純度，可用來(lái)建立雙抗體夾心ELISA方法。

lane M：預(yù)染色蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；lane 1-7 親和層析純化后的7株單克隆抗體。lane M: prestained protein relative molecular standard; lane 1-2 Seven monoclonal antibodies purified by protein G affinity chromatography.圖3 SDS-pAGE 鑒定親和層析純化后單克隆抗體的純度Fig.3 SDS-pAGE analysis of monoclonal antibodies purity after purification by affinity chromatography

2.4 純化后抗體的效價(jià)檢測(cè)

通過(guò)建立的間接ELISA檢測(cè)方法對(duì)7株純化抗體進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)。以2.1倍陰性值設(shè)定為臨界值來(lái)判定是否為陽(yáng)性值。高于2.1倍陰性值即為陽(yáng)性值。檢測(cè)結(jié)果如圖 4和表 3所示：1B5、5E1、5F11純化后抗體效價(jià)達(dá)到1∶3 200以上；5F12純化后抗體效價(jià)達(dá)到1∶6 400 以上；6E5、9E3、12H8純化后抗體效價(jià)達(dá)到1∶12 800以上。

圖4 純化后抗體效價(jià)的檢測(cè)Fig.4 Detection antibody titers of the purified antibodies

表3 純化抗體效價(jià)的檢測(cè)結(jié)果

Tab.3 Antibody titers of the purified monoclonal antibodies

抗體編號(hào)Nameofantibody抗體稀釋度Dilutionratioofantibodies1：4001：8001：16001：32001：64001：128001B55E15F115F126E59E312H8陰性對(duì)照1．9622．0782．0542．3092．3021．8822．1350．0141．7672．0831．8512．3342．1481．5951．8490．0281．2121．7480．9812．3112．2131．9921．7510．0300．6151．1100．6212．0642．1992．0090．7660．0150．1210．2270．1130．5292．1472．5921．1090．0160．1030．1110．0620．2301．7382．6420．4810．010

2.5 間接ELISA法測(cè)定HRp標(biāo)記抗體效率

為建立Tg的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法，利用經(jīng)典的過(guò)碘酸鈉法對(duì)純化后的單克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記，一步法檢測(cè)酶標(biāo)效果。以2.1倍陰性值設(shè)定為臨界值來(lái)判定是否為陽(yáng)性值。高于2.1倍陰性值即為陽(yáng)性值。如圖5所示，7株單克隆抗體均標(biāo)記成功，HRp標(biāo)記的單抗效價(jià)均為1∶5 000以上。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中HRp標(biāo)記的單抗將作為檢測(cè)抗體。

2.6 雙抗體夾心法ELISA包被抗體與檢測(cè)抗體的配對(duì)篩選

對(duì)不同的抗體采用雙抗體夾心法ELISA進(jìn)行配對(duì)篩選。將沒(méi)有標(biāo)記的純化抗Tg蛋白單克隆抗體作為包被抗體，用來(lái)捕獲樣品中的Tg蛋白，HRp標(biāo)記的抗Tg蛋白單克隆抗體用來(lái)作為檢測(cè)抗體， 根據(jù)其與Tg蛋白的反應(yīng)初步分析抗體配對(duì)情況。以2.1倍陰性值設(shè)定為臨界值來(lái)判定是否為陽(yáng)性值。高于2.1倍陰性值即為陽(yáng)性值。結(jié)果如圖 6所示，1B5與其他抗體的配對(duì)效果均較差；5E1可以和9E3、 12H8配對(duì)；5F11、5F12、6E5、9E3、12H8這5株抗體可以互相兩兩配對(duì)；最優(yōu)配對(duì)是5F11為捕獲抗體，12H8為檢測(cè)抗體。在此基礎(chǔ)上，我們將進(jìn)一步使用捕獲抗體5F11和檢測(cè)抗體12H8建立Tg蛋白的雙抗體夾心法檢測(cè)技術(shù)。

圖5 單克隆抗體標(biāo)記效果分析Fig.5 Analysis of the effect of labelled monoclonal antibody with HRp

2.7 雙抗體夾心 ELISA 法的建立

2.7.1 捕獲抗體的包被濃度和檢測(cè)抗體的工作濃度的優(yōu)化

綜合考慮節(jié)約成本和獲得良好的檢測(cè)效果兩方面因素。捕獲抗體包被濃度為10 μg/mL，檢測(cè)抗體稀釋比例為1∶4 000時(shí)，為最適工作條件(圖7，表4)。

2.7.2 雙抗體夾心ELISA法靈敏度的檢測(cè)

篩選到配對(duì)抗體后，不同抗體對(duì)之間的特異性和靈敏度有較大差異。靈敏度較高的配對(duì)抗體在應(yīng)用于臨床樣本的檢測(cè)時(shí)更具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。將Tg蛋白按不同濃度稀釋后，雙抗體夾心法能檢測(cè)到的抗原濃度越低，說(shuō)明配對(duì)抗體的靈敏度越高。以單抗5F11為捕獲抗體，HRp標(biāo)記的單抗12H8為檢測(cè)抗體，不同濃度Tg蛋白為抗原進(jìn)行雙抗體夾心ELISA檢測(cè)，以2.1倍陰性值設(shè)定為臨界值來(lái)判定是否為陽(yáng)性值。高于2.1倍陰性值即為陽(yáng)性 值。本雙抗體夾心ELISA法敏感性可達(dá)1 ng/mL(圖8)。

圖6 包被抗體與捕獲抗體配對(duì)篩選Fig.6 paried screening of coated antibody and detection antibody

圖7 最佳捕獲抗體包被濃度和檢測(cè)抗體工作濃度Fig.7 Optimization of working concentration for coating antibody and detection antibody

表4 最佳捕獲抗體包被濃度和檢測(cè)抗體工作濃度

Tab.4 Optimization of working concentration for coating antibody and dection antibody

檢測(cè)抗體稀釋度Dilutionofdetectionantibody包被抗體濃度Concentrationofcoatingantibody(μg/mL)201052．51．251：20001：40001：80001．0760．8660．3641．0540．9770．3140．9160．8540．3570．8150．6940．3280．6940．6530．258

圖8 配對(duì)抗體靈敏度檢測(cè)Fig.8 The sensitivity of detecting antibody paring

2.8 雙抗體夾心ELISA 法檢測(cè)臨床血清樣本

用最佳的捕獲抗體與檢測(cè)抗體對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和臨床血清樣本進(jìn)行雙抗體夾心法檢測(cè)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(圖9)。以2.1倍陰性值設(shè)定為臨界值來(lái)判定是否為陽(yáng)性值。高于2.1倍陰性值即為陽(yáng)性值。將血清樣本得到的OD值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的公式中，計(jì)算出本實(shí)驗(yàn)方法的檢測(cè)值。將所得檢測(cè)值與臨床值進(jìn)行比對(duì)。經(jīng)過(guò)配對(duì)t檢驗(yàn)，p>0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。線(xiàn)性回歸分析得到相關(guān)系數(shù)R=0.986(圖10)，可以認(rèn)為臨床值與檢測(cè)值相關(guān)性較好。

圖9 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定Fig.9 Determination of standard curve

圖10 臨床值與檢測(cè)值的比較Fig.10 Comparison of clinical value and test value

3 討論

臨床檢測(cè)血清Tg水平的方法有多種，如放射免疫分析法(radioiodine，RIA)、免疫量度分析法(immunometric assay，IMA)、電化學(xué)發(fā)光免疫分析法(electrochemiluminescence immunoassay，CLIA)等[17]。雖然各種檢測(cè)方法技術(shù)已經(jīng)很成熟并趨于規(guī)范化，但血清Tg水平檢測(cè)結(jié)果因?qū)嶒?yàn)室、儀器、試劑以及檢測(cè)方法的不同仍存在很大的差異，不具備良好的可比性[6]。Tg自身抗體(TgAb)對(duì)血清Tg水平的檢測(cè)有很大的干擾，干擾與血清TgAb 的濃度不成正比，干擾程度與抗體的親和力特異性有關(guān)[18]。血清TgAb陽(yáng)性時(shí)，由于TgAb競(jìng)爭(zhēng)抑制電化學(xué)發(fā)光免疫分析法試劑中的標(biāo)記抗體，使得Tg測(cè)定值偏低，引起假陰性；用IMA法測(cè)定的Tg測(cè)定值偏低，引起假陰性；用RIA法Tg測(cè)定值偏高，引起假陽(yáng)性[17]。Tg測(cè)定值的準(zhǔn)確性由檢測(cè)方法所使用抗體的特異性決定[19-21]。因此，獲得高特異性、高靈敏度的單克隆抗體，對(duì)提高Tg測(cè)定方法的靈敏度尤其重要。

血清Tg水平的檢測(cè)結(jié)果因方法間變異較大、批內(nèi)精密度不夠好、靈敏度不夠高而存在很大差異。Tg的檢測(cè)可能受到內(nèi)源性的TgAb、異噬性抗體、高濃度的Tg的鉤狀效應(yīng)等因素的干擾[22,23]。另外一些甲狀腺腫瘤中甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞分泌Tg的過(guò)程改變導(dǎo)致其生化特征發(fā)生變化，使分泌的Tg具有獨(dú)特的表位[24]。而實(shí)驗(yàn)室制備的抗體只能識(shí)別數(shù)量有限的表位，可能會(huì)引起血清Tg水平結(jié)果出現(xiàn)假陰性。

本研究采用天然人Tg蛋白經(jīng)常規(guī)方法免疫小鼠、細(xì)胞融合、亞克隆，制備了7株抗人Tg單克隆抗體，建立了檢測(cè)人血清Tg的雙抗體夾心ELISA的方法，并對(duì)一些臨床血清樣本進(jìn)行檢測(cè)。目前抗人Tg單克隆抗體的制備還具有一定的技術(shù)難度，在很大程度上國(guó)內(nèi)優(yōu)質(zhì)單抗依賴(lài)于進(jìn)口，價(jià)格昂貴，限制了臨床上Tg檢測(cè)的推廣使用。因此，本研究對(duì)建立完善的Tg定量檢測(cè)技術(shù)，研發(fā)低成本檢測(cè)試劑盒和打破對(duì)國(guó)外Tg單克隆抗體產(chǎn)品的依賴(lài)性具有一定意義。

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