王世鳳 黃欣欣 白淘

舒尼替尼作用在晚期腎癌的療效已非常顯著，目前在《診療指南》[1]中明確指出：臨床晚期一線用藥，A類推薦。同時有報道指出：有20%～30%的局限性腎癌術(shù)后出現(xiàn)進展。隨著影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展、人民群眾健康意識的提高，越來越多的腎癌患者被早期發(fā)現(xiàn)。山西地區(qū)的多中心研究[2]也證實了這一點。本研究通過動物實驗，了解早期靶向藥物使用的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

人腎透明細胞癌786-O細胞，雄性BALB/C裸鼠42只，舒尼替尼，穿刺針，即用型免疫組化試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 腎癌786-O細胞接種、傳代培養(yǎng)。

1.2.2 動物模型的建立 將癌細胞懸浮于PBS中，調(diào)整細胞濃度至5×107個/ml，取0.1 ml注射入裸鼠背部皮下。

1.2.3 動物模型的檢驗 用活檢穿刺針取腫瘤，病理證實。分別于第5、20、35天和/或死亡后穿刺活檢。

1.2.4 分組 按照不同給藥干預(yù)時間分三組，每組裸鼠10只，模擬早、中、晚期給藥，同時設(shè)立對照組裸鼠12只。

1.2.5 給藥方式 給藥組按7.5 mg/（kg·d）灌食，對照組給予等體積蒸餾水，分別于對應(yīng)天數(shù)測定瘤組織中相關(guān)蛋白表達與否、腫瘤大小、記錄生存時間，并于每次穿刺檢測后開始下一組給藥。

1.2.6 相關(guān)指標的蛋白表達測定 HIF，VEGF，VEGFR，PDGFR。

1.2.7 HE染色、免疫組化染色實驗步驟 步驟（Envision法）略。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

表1 給藥前四組之間各檢測指標陽性率及體積比較 [n（%）]（±s）

表1 給藥前四組之間各檢測指標陽性率及體積比較 [n（%）]（±s）

早期給藥組 10 4（40.0） 7（70.0） 7（70.0） 9（90.0） 151.60±5.38中期給藥組 10 5（50.0） 7（70.0） 7（70.0） 8（80.0） 151.10±5.44晚期給藥組 10 6（60.0） 6（60.0） 6（60.0） 8（80.0） 150.60±4.84對照組 12 6（50.0） 8（66.7） 7（58.3） 8（66.7） 151.42±5.38 χ2/F值 - 0.800 0.472 0.683 1.776 0.070 P值 - 0.849 1.000 0.920 0.687 0.975

表2 給藥后第4次檢測四組之間各檢測指標陽性率及體積比較 [n（%）]（±s）

表2 給藥后第4次檢測四組之間各檢測指標陽性率及體積比較 [n（%）]（±s）

早期給藥組 10 5（50.0） 7（70.0） 4（40.0） 4（40.0） 146.20±4.46中期給藥組 10 6（60.0） 6（60.0） 4（40.0） 4（40.0） 147.20±4.69晚期給藥組 10 7（70.0） 9（90.0） 5（50.0） 6（60.0） 151.90±5.22對照組 12 7（58.3） 10（83.3） 9（75.0） 12（100.0） 158.58±3.58 χ2/F值 - 0.950 2.918 3.693 12.468 356.106 P值 - 0.906 0.443 0.284 0.004 ＜0.001

采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理，計量資料以（均數(shù)±標準差）表示，兩個樣本均數(shù)比較采用t檢驗，多于兩組樣本均數(shù)的比較，采用方差分析（ANOVA）；計數(shù)資料以（n，%）表示，采用χ2檢驗。不同指標之間相關(guān)性采用Spearman秩和檢驗，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 給藥后各組之間相關(guān)因子表達情況及腫瘤大小比較

由表1可見，經(jīng)χ2、Fisher’s確切概率法檢驗，各組之間在給藥前HIF、VEGF、VEGFR、PDGFR陽性表達率對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；經(jīng)ANOVE方差分析，各組之間腫瘤體積大小對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.070，P=0.975）。提示各組之間在給藥前各指標均衡可比。

2.2 給藥后各組之間相關(guān)因子表達情況及腫瘤大小比較

對各組之間第4次穿刺結(jié)果進行比較。由表2可見，各組之間PDGFR陽性表達率對比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=12.468，P=0.004），早期給藥組和中期給藥組陽性表達率最低。經(jīng)相關(guān)分析，PDGFR陽性表達率與給藥時間呈正相關(guān)（r=0.485，P=0.001）。

經(jīng)ANOVE方差分析，各組之間腫瘤體積大小對比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=356.106，P＜0.001）。經(jīng)兩兩比較，對照組腫瘤體積均大于各給藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；晚期給藥組腫瘤體積分別大于早期、中期給藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，給藥時間與終期腫瘤大小呈正相關(guān)（r=0.491，P=0.006）。

3 討論

腎癌的生長和侵襲是一個復(fù)雜的過程[3-4]。VHL-HIF-EPO通路中靶基因VEGF轉(zhuǎn)錄活性和表達增強，并上調(diào)了VEGFR的轉(zhuǎn)錄及表達[5-6]。TKI在腎癌中因其雙向抑制作用，成為轉(zhuǎn)移性腎癌的一線用藥，特別是VEGFR3 rs307826野生純合子型（AA型），患者進展風險降低72%，本團隊在前期實驗過程中，SNP檢測15例患者均為AA型。本團隊與國內(nèi)前期檢測結(jié)果[7]相似，遠高于歐美83.1%檢出率，眾多國內(nèi)外數(shù)據(jù)顯示[8-9]：在蘋果酸舒尼替尼基于基因水平的靶向治療腎細胞癌方面，國人較歐美人群可獲得更多收益。國內(nèi)單中心研究[10-12]數(shù)據(jù)：進一步證實TKI在中國晚期腎癌中療效確切。由于缺乏用藥指標，遺憾的是尚無可推薦的標準輔助治療方案使局部進展期和局限性腎癌手術(shù)患者獲益，有20%～30% T1b～T2期患者腎癌手術(shù)后1～2年內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移，16%的腎癌會局部進展，術(shù)后40%腎癌會復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移[1]。

本研究結(jié)果顯示，造模成功后第一次穿刺組織經(jīng)多種統(tǒng)計方法證實：各組之間在HIF、VEGF、VEGFR、PDGFR陽性表達率及腫瘤大小對比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示各組之間在給藥前各指標均衡可比。對各組及各組之間4次穿刺結(jié)果進行比較：早期、中期給藥組較其它組顯示，給藥時間越長，PDGFR陽性表達率越低，腫瘤體積越小。晚期給藥PDGFR、腫瘤體積變化不顯著，提示早期給藥較晚期給藥可以更好地抑制癌細胞的進展。而HIF、VEGF及其受體的表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與相關(guān)研究相悖，可能的原因與實驗設(shè)計動物例數(shù)少有關(guān)；腫瘤體積在種植成功至第一次穿刺時變化較大，可能的原因是種植于鼠背皮下相對疏松的組織，在種植形成皮丘過程中加劇了周圍組織的水腫，使得癌細胞有了更適宜的生長空間，10～15天，種植造成的水腫環(huán)境被機體代償、吸收，所以當腫瘤體積達到150 mm時各組都出現(xiàn)生長相對緩慢 。

綜上所述，早期靶向藥物干預(yù)較晚期干預(yù)，對于控制疾病進展有明顯的作用。目前擺在面前的問題是：如何將未來會有疾病進展的患者篩選出來。

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