許翠婭，楊 芳，羅冬蓮，陳小紅，魏姍姍，余 穎，陳財珍

(1.福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013；2.福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門 361013)

苯系物(BTEX)屬于單環(huán)芳香烴類，是石油類物質(zhì)中常見的烷基苯類化合物，廣泛存在于化工行業(yè)或石油相關(guān)行業(yè)中[1]。苯系物易揮發(fā)，具有一定的溶解性，隨著石油工業(yè)的迅速發(fā)展，在采油、煉油、石油運輸?shù)冗^程中，苯系物很容易進入大氣和水體中，進而對生態(tài)系統(tǒng)、水生生物和人類健康造成威脅[2]。目前，國內(nèi)外有關(guān)苯系物的研究主要集中于大氣、土壤、沉積物和淡水，對海水中苯系物的研究相對較少。對海洋環(huán)境中苯系物的研究集中于苯系物的檢測技術(shù)、微生物修復(fù)等，關(guān)于苯系物的水生生態(tài)毒性報道相對較少[3-6]，《海水水質(zhì)標準》(GB 3097—1997)中也沒有苯系物的標準限值。

海洋貝類對環(huán)境污染物具有很強的富集性，通常被用作海洋污染物的指示生物。皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)具有很高的經(jīng)濟價值，是目前我國最廣泛的貝類養(yǎng)殖品種之一，也是福建海域貝類養(yǎng)殖的主導(dǎo)種之一。目前關(guān)于苯系物對海洋貝類的生態(tài)毒理學(xué)研究尚不多見[6]，對皺紋盤鮑的毒性效應(yīng)研究也尚未見相關(guān)報道。因此，開展苯系物對皺紋盤鮑的毒性效應(yīng)研究可以考察貝類對苯系物污染的耐受能力和海洋生態(tài)系統(tǒng)的健康水平，可為評估苯系物對海洋環(huán)境和水產(chǎn)品質(zhì)量安全的風險提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)，并為科學(xué)制訂苯系物的水環(huán)境質(zhì)量標準提供理論依據(jù)，在海洋環(huán)境中苯系物泄露的突發(fā)事件處理中，本研究成果也可為管理部門的決策提供技術(shù)支撐和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試生物

試驗用皺紋盤鮑均購自福建省東山縣馬鞍嶼水產(chǎn)養(yǎng)殖場，選擇活力好、健康、無外傷的鮑，采用網(wǎng)兜扎緊(20只/袋)、冰塊降溫的方法，約2 h運輸?shù)礁＝ㄊ∷a(chǎn)研究所生態(tài)實驗室。將鮑置于規(guī)格5 L的玻璃燒杯，按試驗密度進行暫養(yǎng)(20只·5 L-1)，以避免二次轉(zhuǎn)移對鮑造成的機械損傷。暫養(yǎng)7 d，期間每日定時換水和投喂江蘺，全天充氣，暫養(yǎng)期間鮑活力良好、攝食正常，死亡率為0.5%，符合急性毒性試驗標準(<10%)[7]。試驗前24 h停止喂食。試驗前隨機抽取50只鮑進行生物性狀測量，試驗鮑殼長為(3.8±0.5)cm，體重為(6.2±2.0)g。

1.2 試驗藥劑與儀器

試驗藥劑：苯、甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯、對二甲苯和無水乙醇，均為分析純，由國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。母液配制：試驗使用助溶劑無水乙醇配制母液，母液于每次試驗前配得，當日使用，助溶劑不超過0.1 mg·L-1[7]。試驗常規(guī)理化因子(水溫、鹽度、pH和溶解氧)用WTW Multi3430多參數(shù)分析儀進行測定。

1.3 試驗方法與條件

試驗在5 L的玻璃燒杯中進行，試驗溶液體積為5 L，每個燒杯放入20只鮑。試驗周期為96 h，期間不喂食。為滿足試驗鮑對溶解氧的需求，試驗海水在使用前充分曝氣，試驗期間采用不間斷微充氣的方法，保證試驗水體中溶解氧≥4 mg·L-1。為保證毒性試驗過程中溶液濃度保持在初始濃度的80%以上[7]，試驗容器玻璃燒杯采用保鮮膜、Parafilm封口膜和錫箔紙封口。試驗方式為半靜態(tài)，每12 h換1次水并檢查記錄鮑死亡情況，挑出死亡鮑(死亡判定標準：腹足無自主吸附力，通常腹足朝上，無法翻轉(zhuǎn)，個別靠物理吸附力附著但脫落后無法再吸附，多次觸碰后無反應(yīng))。

依據(jù)相關(guān)急性毒性試驗方法[7-8]，經(jīng)預(yù)實驗，分別確定苯、甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯、對二甲苯的正式試驗濃度范圍，按等對數(shù)間距法設(shè)置5個質(zhì)量濃度梯度組，每個濃度組設(shè)3個平行組，并設(shè)空白對照組(不添加任何試劑)和助溶劑對照組(無水乙醇濃度100 μL·L-1)。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，苯正式試驗濃度設(shè)置為24.91、31.04、38.66、48.16和60.00 mg·L-1；甲苯正式試驗濃度設(shè)置為22.92、28.34、35.03、43.30和53.53 mg·L-1；鄰二甲苯和間二甲苯的正式試驗濃度設(shè)置為10.00、13.99、19.58、27.39和38.32 mg·L-1；對二甲苯正式試驗濃度設(shè)置為3.62、5.00、6.90、9.52和13.13 mg·L-1。

試驗所用的海水取自廈門海域，經(jīng)沉淀砂濾后使用，添加海水晶調(diào)節(jié)鹽度至(30.0±0.1)，在實驗室充分曝氣備用。試驗期間海水水溫為(19±1)℃，pH為 7.22～8.09，溶解氧為4.77～9.72 mg·L-1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果采用SPSS 23軟件進行分析，利用Pearson相關(guān)分析判斷劑量和死亡率的相關(guān)性，然后進行概率回歸分析，求得LC50值及其95%置信區(qū)間和回歸方程。

安全濃度(SC)的計算公式：SC=96 h LC50(96 h半致死濃度)×AF(應(yīng)用系數(shù))，一般來說，對不穩(wěn)定而又很少產(chǎn)生殘留的化學(xué)物質(zhì)，常用0.1作為應(yīng)用系數(shù)[9]，依據(jù)苯系物的化學(xué)特性，AF取值0.1。

2 結(jié)果

2.1 中毒癥狀

試驗鮑在5種苯系物溶液中的中毒癥狀相似，試驗中觀察到，隨著藥物濃度的增加和時間的推移，試驗鮑分泌大量的黏液，呈泡沫狀浮于水面(高濃度組尤為明顯)，試驗水體逐漸變渾濁。在較高濃度苯系物的海水中，鮑中毒反應(yīng)明顯，表現(xiàn)為：試驗鮑明顯不適，初時鮑殼左右扭轉(zhuǎn)，一段時間后鮑肌肉松弛，附著力減弱，漸漸脫離杯壁，腹足朝上臥于杯底，腹足蠕動掙扎但無法翻身，逐漸死亡；個別試驗鮑掙扎后靜臥于杯底，逐漸死亡。

在低濃度苯系物的海水中鮑中毒反應(yīng)較不激烈，中毒后死亡的鮑一般表現(xiàn)為：初時試驗鮑緊閉殼吸附于杯壁，一段時間后鮑肌肉松弛，附著力減弱，漸漸脫離杯壁，腹足朝上臥于杯底，腹足蠕動但無法翻身，逐漸死亡；部分試驗鮑無明顯掙扎，靜臥于杯底死亡；個別試驗鮑靜靜吸附于杯壁，人工剝離后觸之無反應(yīng)，已死亡。

瀕死的鮑活力明顯下降，附著力弱，觸角和腹足肌肉松弛，觸之反應(yīng)遲鈍，呈麻痹狀。中毒癥狀較輕的鮑一般不喜活動，附著力較弱，容易被剝離杯壁。對照組的鮑一般白天緊附于杯底，吸附力強，夜間活動。

2.2 苯系物對皺紋盤鮑的急性毒性

試驗過程中，空白對照組和助溶劑對照組的試驗鮑均未死亡，符合急性毒性試驗標準方法的要求[7]。急性毒性試驗結(jié)果顯示，不同濃度的藥物對皺紋盤鮑造成不同程度的毒害，隨藥物濃度的增加和試驗進程的推進，鮑死亡率呈逐漸上升的趨勢(圖1～圖5)。對苯系物濃度和皺紋盤鮑死亡率進行劑量-效應(yīng)相關(guān)性分析，得到Pearson相關(guān)系數(shù)(表1)，試驗結(jié)果表明，5種苯系物對皺紋盤鮑毒性作用存在明顯的劑量-效應(yīng)相關(guān)關(guān)系。

在苯的急性毒性試驗中，最低濃度組(24.91 mg·L-1)在72 h內(nèi)鮑沒有出現(xiàn)死亡，96 h鮑的死亡率為8.5%；最高濃度組(60.00 mg·L-1)24 h和48 h鮑的死亡率分別為55.0%和100%。苯對皺紋盤鮑的24 h、48 h、72 h和96 h LC50分別為57.11、41.23、38.25和33.37 mg·L-1，苯系物對皺紋盤鮑24 h、48 h、72 h和96 h LC50的95%置信區(qū)間見表1，其中苯對皺紋盤鮑96 h LC50的95%置信區(qū)間為30.40～36.39 mg·L-1。

在甲苯的急性毒性試驗中，最低濃度組(22.92 mg·L-1)在24 h內(nèi)鮑沒有出現(xiàn)死亡，48 h鮑的死亡率為5.0%，96 h鮑的死亡率為32.5%；最高濃度組(53.53 mg·L-1)24 h、48 h和72 h鮑的死亡率分別為75.0%、85.0%和100%。甲苯對皺紋盤鮑的24 h、48 h、72 h和96 h LC50分別為46.14、37.98、30.38和25.24 mg·L-1，其中96 h LC50的95%置信區(qū)間為23.03～27.01 mg·L-1。

在鄰二甲苯的急性毒性試驗中，最低濃度組(10.00 mg·L-1)在96 h內(nèi)鮑沒有出現(xiàn)死亡；13.99 mg·L-1濃度組在48 h內(nèi)鮑沒有出現(xiàn)死亡，72 h和96 h鮑的死亡率分別為35.0%和50.0%；最高濃度組(38.32 mg·L-1)24 h和48 h鮑的死亡率分別為52.5%和100%。鄰二甲苯對皺紋盤鮑的24 h、48 h、72 h和96 h LC50分別為37.51、23.34、17.91和15.61 mg·L-1，其中96 h LC50的95%置信區(qū)間為13.88～17.40 mg·L-1。

在間二甲苯的急性毒性試驗中，最低濃度組(10.00 mg·L-1)在48 h內(nèi)鮑沒有出現(xiàn)死亡，72 h和96 h鮑的死亡率分別為15.0%和20.0%；最高濃度組(38.32 mg·L-1)24 h、48 h和72 h鮑的死亡率分別為62.5%、80.0%和100%。間二甲苯對皺紋盤鮑的24 h、48 h、72 h和96 h LC50分別為35.61、25.96、15.12和12.84 mg·L-1，其中96 h LC50的95%置信區(qū)間為11.55～14.20 mg·L-1。

在對二甲苯的急性毒性試驗中，最低濃度組(3.62 mg·L-1)在48 h內(nèi)鮑沒有出現(xiàn)死亡，72 h和96 h鮑的死亡率分別為1.5%和8.5%；最高濃度組(13.13 mg·L-1)24 h、48 h和72 h鮑的死亡率分別為67.5%、92.5%和100%。對二甲苯對皺紋盤鮑的24 h、48 h、72 h和96 h LC50分別為11.07、7.69、5.43和4.81 mg·L-1，其中96 h LC50的95%置信區(qū)間為4.42～5.25 mg·L-1。

國家環(huán)境保護總局1986年制訂的《環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范 第四冊 生物監(jiān)測(水環(huán)境部分)》中，將化學(xué)物質(zhì)對水生生物的毒性劃分為5個等級：LC50<1 mg·L-1為劇毒；LC50=1～100 mg·L-1為高毒；LC50=100～1 000 mg·L-1為中毒；LC50=1000～10 000 mg·L-1為低毒；LC50>10 000 mg·L-1為微毒或無毒。參照此標準，苯、甲苯和3種二甲苯對皺紋盤鮑均為高毒物質(zhì)。經(jīng)驗公式計算結(jié)果：苯、甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯、對二甲苯對皺紋盤鮑的安全濃度分別為3.34、2.52、1.56、1.28和0.48 mg·L-1。

表1 苯系物對皺紋盤鮑的LC50及毒性試驗回歸方程

續(xù)表1

注：Y為死亡率；X為物質(zhì)濃度對數(shù)。

Notes：Ywas mortality rate；Xwas substance concentration logarithm.

3 討論

苯系物為一類易揮發(fā)的單環(huán)芳香烴類化合物。有機污染物毒性作用可分為麻醉型毒性和反應(yīng)型毒性[10]。麻醉型毒性有機物對生物的毒性較低，通常表現(xiàn)為不同程度的致麻醉作用。致麻醉作用幾乎是所有有機物最起碼的生物效應(yīng)，稱為基本毒性。麻醉型毒性又分為非極性麻醉和極性麻醉。非極性麻醉型化合物為疏水性物質(zhì)，不與生物大分子結(jié)合，其急性毒性主要表現(xiàn)為對膜的穿透破壞作用。極性麻醉型化合物是分子結(jié)構(gòu)中具有強失電子的氨基、羥基的芳烴化合物，其毒性作用高于基本毒性[11]。從皺紋盤鮑的中毒癥狀來看，試驗鮑出現(xiàn)了反應(yīng)遲鈍、肌肉松弛、附著力減弱等麻醉狀態(tài)，符合麻醉型毒性的中毒癥狀。

急性毒性試驗結(jié)果表明，5種苯系物對皺紋盤鮑毒性大小順序為：對二甲苯>間二甲苯>鄰二甲苯>甲苯>苯。以96 h LC50來比較，對二甲苯的毒性效應(yīng)相當于7倍苯的毒性效應(yīng)，約等于5倍甲苯的毒性效應(yīng)；鄰二甲苯和間二甲苯對皺紋盤鮑的毒性效應(yīng)差異不顯著，對二甲苯對鮑的毒性效應(yīng)約等于3倍鄰、間二甲苯的毒性效應(yīng)。一般認為，非極性麻醉型化合物引起麻醉的能力主要與疏水性大小有關(guān)，根據(jù)相似相溶原理，生物體內(nèi)細胞膜及細胞中的類脂物質(zhì)都會吸附麻醉化合物，疏水性越大，則非極性麻醉型化合物就越容易非選擇性地透過細胞膜，所以非極性麻醉型化合物的毒性大小可以根據(jù)辛醇-水分配系數(shù)來確定[12]。我國學(xué)者王連生等和戴朝霞等認為，芳香烴類有機物分子結(jié)構(gòu)會影響生物活性以及毒性作用大小，化合物分析結(jié)構(gòu)大小貢獻的順序為：疏水性>親水性>電性效應(yīng)>空間效應(yīng)[13-14]。本試驗中的苯系物均屬非極性麻醉型化合物，苯、甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯和對二甲苯20℃辛醇-水分配系數(shù)logKow分別是2.13、2.69、2.77、3.20和3.15 mg·L-1[15]，所以它們的疏水性大小順序為二甲苯>甲苯>苯。根據(jù)以上理論，二甲苯更容易通過皺紋盤鮑的細胞膜并對其產(chǎn)生毒性作用，其次為甲苯和苯。這與本試驗得到的結(jié)果相吻合。

姜北、范亞維等、李學(xué)峰等、鄭師梅等也開展了苯系物的急性毒性研究[5，16-18]，姜北在苯系物對仿刺參的急性毒性試驗的研究表明，6種苯系物對仿刺參的毒性效應(yīng)大小順序是：對二甲苯>間二甲苯>鄰二甲苯>乙苯>甲苯>苯，苯系物對仿刺參的96 h半數(shù)致死濃度分別是：苯101.61 mg·L-1、甲苯58.28 mg·L-1、乙苯43.42 mg·L-1、鄰二甲苯34.58 mg·L-1、間二甲苯27.19 mg·L-1、對二甲苯20.25 mg·L-1。此研究結(jié)果中苯系物毒性效應(yīng)大小順序與本試驗的結(jié)果一致。范亞維等的研究表明，水體中甲苯、乙苯和二甲苯對斑馬魚96 h LC50分別為77.5、31.0和34.8 mg·L-1；李學(xué)峰等的研究結(jié)果為，甲苯、乙苯和二甲苯對中華新米蝦的96 h LC50分別為13.8、10.4和11.3 mg·L-1，二者的研究結(jié)果均表明3種苯系物的毒性大小順序為乙苯>二甲苯>甲苯，也與本研究結(jié)果相似。鄭師梅的研究表明，在預(yù)實驗中，苯系物引起銅繡環(huán)棱螺死亡的濃度高達500 mg·L-1，遠遠高于引起螺行為變化的濃度，試驗以螺的行為變化作為毒性效應(yīng)指標來研究苯系物對銅繡環(huán)棱螺的急性毒性，結(jié)果表明：甲苯、乙苯和二甲苯對銅銹環(huán)棱螺不良反應(yīng)的96 h EC50分別為37.2、13.3和8.9 mg·L-1，毒性大小順序為二甲苯>乙苯>甲苯。銅銹環(huán)棱螺和皺紋盤鮑均隸屬于軟體動物門腹足綱，從試驗結(jié)果來看，苯系物對皺紋盤鮑的毒性效應(yīng)明顯大于對銅銹環(huán)棱螺的毒性效應(yīng)。從以上研究結(jié)果來比較，相對于仿刺參、斑馬魚、中華新米蝦、銅繡環(huán)棱螺，皺紋盤鮑對苯系物的敏感程度相對較高。

目前《生活飲用水衛(wèi)生標準》(GB 5749—2006)、《地表水環(huán)境質(zhì)量標準》(GB 3838—2002)中對集中式生活飲用水地表水源中的苯系物規(guī)定了標準限值，苯、甲苯和二甲苯的標準限值分別為0.01、0.7和0.5 mg·L-1，而《海水水質(zhì)標準》(GB 3097—1997)和《漁業(yè)水質(zhì)標準》(GB 11607—1989)中均無苯系物標準限值。苯、甲苯、二甲苯均具有很強的生物毒性，對人體而言，苯的毒性最大，已確定為致癌物，可導(dǎo)致白血病和淋巴瘤[19]，還具有致畸作用，引起染色體斷裂和阻礙染色體分離[20]；甲苯具有神經(jīng)毒性和致畸作用[21]；二甲苯對人的神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟和腎臟具有損傷作用[22-23]。依據(jù)其對人體的危害程度，相關(guān)飲用水衛(wèi)生標準對苯系物的標準限值，尤其是對苯進行了嚴格的規(guī)定。不同的生物對污染物的敏感性存在差異，目前苯系物對水生生物的毒性效應(yīng)研究開展得較少，對苯系物中毒機制的研究也不夠深入，因此亟需開展相關(guān)研究，為科學(xué)制訂苯系物水環(huán)境質(zhì)量標準以及排放標準提供理論依據(jù)。

致謝：福建省水產(chǎn)研究所的鄭惠東、王雪玲、馬文學(xué)、陳月忠、錢小明、陳思等參與了本試驗，謹致謝忱。

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