余 穎

(福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門361013)

三唑類農(nóng)藥是一類含有1，2，4-三唑環(huán)的有機含氮雜環(huán)化合物，是20世紀70年代發(fā)展起來的一種殺菌劑，主要產(chǎn)品有三唑醇、烯唑醇、己唑醇、三唑酮、丙環(huán)唑和氟硅唑等30多個品種。這類農(nóng)藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)式上相同的部分是主鏈上含有羥基(酮基)、取代苯基和1，2，4-三唑基團化合物。三唑類農(nóng)藥具有內(nèi)吸殺菌活性、廣譜、高效和低毒等特點，有的還具有植物生長調(diào)節(jié)作用。同時，它的一些特殊理化性質(zhì)也使其具有長期有效和活性高的特性[1-3]。農(nóng)藥通過地表徑流、淋溶、沉降等方式進入漁業(yè)環(huán)境，對漁業(yè)環(huán)境和水產(chǎn)養(yǎng)殖造成間接或直接的危害。人類食用被農(nóng)藥污染的水產(chǎn)品，就有可能致畸、致癌、誘變，以及對神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生影響和引起免疫系統(tǒng)的過敏反應(yīng)等[4]。

國內(nèi)外常用的三唑類農(nóng)藥檢測方法主要有以下幾類：1)液相色譜法，主要有分散液相微萃取-高效液相色譜法[5-6]、分子印跡固相萃取-高效液相色譜法[7-9]等；2)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，如超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-12]、分子印跡固相萃取-液相色譜-質(zhì)譜法[13]、QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14]等；3)氣相色譜法[15-17]；4)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，如中空纖維膜液相微萃取-GC-MS法[18]、凝膠滲透色譜-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[19]、分散液-液微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法[20-21]、氣相色譜-負化學(xué)離子源質(zhì)譜法[22]等。三唑類農(nóng)藥殘留檢測方法研究已在水質(zhì)、果蔬等基質(zhì)中廣泛開展，但在動物源基質(zhì)中的研究鮮有報道，水產(chǎn)品中三唑類農(nóng)藥多組分殘留的檢測方法研究尚處空白。本研究采用微電子捕獲檢測器的氣相色譜法進行檢測，建立了水產(chǎn)品中4種三唑類農(nóng)藥殘留量的檢測方法。微電子捕獲檢測器的氣相色譜法具有較高的靈敏度，不僅能夠滿足水產(chǎn)品中三唑類農(nóng)藥痕量殘留檢測的需求，也為三唑類農(nóng)藥相關(guān)標準的制定及其日常監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜儀(美國Agilent公司，6890N，帶63Ni微電子捕獲檢測器)；離心機(北京時代北利離心機有限公司，LD4-8)；氮吹儀(天津恒奧科技發(fā)展有限公司，HGC-24)；旋渦振蕩器(德國IKA公司，MS3)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司，R205)；固相萃取裝置(美國Alltech公司)；數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，KQ-250DE)。

乙腈、丙酮、正己烷為色譜純；無水硫酸鈉(650℃灼燒4 h，冷卻后貯于干燥器中備用)為分析純；石墨化碳黑-弗羅里硅土復(fù)合柱(CNW，1 000 mg/250 mg/6 mL)。

標準物質(zhì)三唑酮、三唑醇、聯(lián)苯三唑醇和環(huán)丙唑醇購于德國Dr.Ehrenstorfer公司，分別用丙酮配制成10 μg/mL的標準溶液，儲存于4℃冰箱中，使用時再用丙酮配制成所需濃度的混合標準工作液。

1.2 樣品前處理方法

1.2.1 試樣制備

取待測水產(chǎn)品的可食部分，并充分均質(zhì)、混勻；將試樣于-18℃以下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 提取

稱取5 g樣品(精確至0.01 g)置于50 mL離心管中，加入15 mL乙腈，旋渦振蕩30 s，超聲提取10 min。3 500 r/min離心5 min，移取上清液過無水硫酸鈉后收集于100 mL雞心瓶中。再往樣品中加入10 mL乙腈重復(fù)提取一次，合并上清液于100 mL雞心瓶中，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。用1 mL正己烷溶解雞心瓶中的殘留物，待凈化。

1.2.3 凈化

石墨化碳黑-弗羅里硅土柱用5 mL正己烷，5 mL丙酮-正己烷(1∶9，V/V)溶液活化，樣液過柱并收集，用12 mL丙酮-正己烷(1∶9，V/V)溶液洗脫，收集洗脫液。將洗脫液于40℃氮吹至近干，用正己烷定容至1 mL，供氣相色譜分析。

1.3 分析條件

色譜柱：DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：起始溫度150℃，保持1 min，以15℃/min升到280℃保持5 min，再以20℃/min升到300℃保持3 min；進樣口溫度：280℃，進樣方式：不分流進樣，進樣體積為1 μL；檢測器溫度：300℃；載氣：高純氮氣(純度≥99.999%)，流速1.0 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 氣相色譜分析條件優(yōu)化

已報道的三唑類農(nóng)藥的氣相色譜分析方法中，色譜柱通常采用弱極性的DB-1MS[17]或DB-5MS[18]和中等極性的DB-17MS[22]。本研究比較了DB-5MS和DB-17MS這兩種色譜柱對4種三唑類農(nóng)藥的響應(yīng)值及分離效果。結(jié)果表明，2種色譜柱都能將4種目標物完全分離，但采用DB-5MS色譜柱可獲得響應(yīng)值更高的目標峰且峰型尖銳對稱，對目標物的定性與定量更加準確。進樣口溫度是對目標物響應(yīng)值有較大影響的條件之一，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上確定進樣口溫度為280℃，可在不引起樣品分解的情況下，使樣品全部組分完全汽化，以獲得最佳響應(yīng)值。按1.3已優(yōu)化的分析條件，4種三唑類農(nóng)藥混合標準溶液(三唑酮濃度為2.5 ng/mL，三唑醇、聯(lián)苯三唑醇和環(huán)丙唑醇濃度為50.0 ng/mL)的色譜圖見圖1。

2.2 樣品前處理方法的研究

2.2.1 提取溶劑的選擇

水產(chǎn)品中含有較多的蛋白質(zhì)、油脂和色素等物質(zhì)，基質(zhì)比較復(fù)雜，為了降低后續(xù)樣品凈化的難度，應(yīng)選擇對目標物溶解性好且對雜質(zhì)溶出盡可能小的溶劑。已報道的研究常采用乙酸乙酯、乙腈、正己烷、石油醚或丙酮等作為提取溶劑。本研究比較了乙酸乙酯、乙腈和正己烷對4種三唑類農(nóng)藥的提取效果，結(jié)果見圖2。乙酸乙酯對4種目標物的提取率無法都達到滿意的效果，且雜質(zhì)峰較多，基線噪音大，對目標物的準確定性和定量造成干擾。乙腈的提取效果優(yōu)于正己烷，且正己烷對油脂及色素的溶解度也較大，會增加后續(xù)凈化的難度。因此選擇乙腈為提取溶劑，可獲得較滿意的提取效果。

2.2.2 凈化方法

由于水產(chǎn)品基質(zhì)的復(fù)雜性會干擾三唑類農(nóng)藥的定性定量分析，并對色譜柱及檢測器造成污染，且乙腈會使蛋白質(zhì)變性造成提取液渾濁，因此有必要對乙腈提取液進行有效凈化。固相萃取是已報道的較常用的三唑類農(nóng)藥提取液的凈化方式。固相萃取不僅能對復(fù)雜樣品基質(zhì)進行有效凈化，還可富集樣品中的極低濃度組分，并減少色譜應(yīng)用中的基質(zhì)效應(yīng)，在水產(chǎn)品痕量殘留的檢測中得到廣泛應(yīng)用。由于弗羅里硅土柱是三唑類農(nóng)藥殘留檢測中較常用的固相萃取柱，其對目標物各組分的回收率高，且能有效去除雜質(zhì)，使雜質(zhì)峰與目標峰完全分離，而且部分含有色素的水產(chǎn)品如甲殼類、某些貝類等，石墨化碳黑能較好地吸附色素，使凈化效果更理想，因此本研究采用石墨化碳黑-弗羅里硅土復(fù)合柱對乙腈提取液進行凈化，進一步去除雜質(zhì)，能滿足檢測分析要求。

1)洗脫液的選擇

本研究比較了不同體積比的丙酮-正己烷溶液對4種三唑類農(nóng)藥的洗脫效果。分別比較了體積比為1∶9、3∶7、5∶5這3種溶液，結(jié)果見圖3，丙酮-正己烷溶液體積比為1∶9時，固相萃取柱上的待測組分基本能洗脫下來，回收率高于另兩種體積比的溶液，能滿足檢測要求。

注：1為丙酮-正己烷(1∶9，V/V)；2為丙酮-正己烷(3∶7，V/V)；3為丙酮-正己烷(5∶5，V/V)。

Notes：1 indicated acetone-n-hexane(1∶9，V/V)；2 indicated acetone-n-hexane(3∶7，V/V)；3 indicated acetone-n-hexane(5∶5，V/V).

2)洗脫體積的優(yōu)化

確定洗脫液之后，對洗脫液體積進行優(yōu)化，使目標物能從固相萃取柱上完全洗脫下來。將5 g空白樣品按1.2.2法提取，提取液加入4種三唑類混合標準溶液(三唑酮濃度為25 ng/mL，三唑醇、聯(lián)苯三唑醇和環(huán)丙唑醇濃度為500 ng/mL)，濃縮液過石墨化碳黑-弗羅里硅土復(fù)合柱，用丙酮-正己烷(1∶9，V/V)溶液洗脫，收集不同體積的洗脫液，測定各目標物的回收率。結(jié)果見圖4，在洗脫體積為12 mL時，目標物各組分可完全被洗脫。

按優(yōu)化后的樣品前處理方法所得的日本對蝦空白樣品和加標樣品(添加濃度分別為三唑酮0.4 μg/kg，三唑醇、聯(lián)苯三唑醇和環(huán)丙唑醇8.0 μg/kg)色譜圖見圖5～圖6。結(jié)果表明，該方法前處理過程步驟少易操作，有機試劑用量少，樣品凈化效果較理想，適用于大量樣品的快速檢測。

2.3 方法有效性的評價

2.3.1 線性范圍、檢出限和最低定量限

將4種三唑類農(nóng)藥標準儲備液用丙酮配制成不同質(zhì)量濃度的系列標準混合溶液，濃度分別為三唑酮1.25、2.50、25.00、62.50、125.00 ng/mL，三唑醇、環(huán)丙唑醇和聯(lián)苯三唑醇25、50、500、1 250、2 500 ng/mL，進行氣相色譜分析，外標法定量。以標準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，峰高為縱坐標，繪制標準曲線，計算相關(guān)系數(shù)。方法檢出限是以信噪比≥3估算，三唑醇、環(huán)丙唑醇和聯(lián)苯三唑醇檢出限均為4.0 μg/kg，三唑酮的檢出限為0.2 μg/kg。最低定量限的確定依據(jù)實際樣品加標回收率在70%～120%之間，信噪比≥10，相對標準偏差≤15%時所對應(yīng)的濃度值。實驗中4種三唑類各組分加標濃度分別為三唑酮0.4 μg/kg，三唑醇、環(huán)丙唑醇和聯(lián)苯三唑醇8 μg/kg時，平均回收率為83.6%～86.6%，相對標準偏差為2.77%～10.7%，且信噪比大于10。因此，本方法確定三唑酮的最低定量限為0.4 μg/kg，三唑醇、聯(lián)苯三唑醇和環(huán)丙唑醇的最低定量限均為8.0 μg/kg。各組分的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和最低定量限見表1，三唑酮在1.25～ 125.00 ng/mL，三唑醇、聯(lián)苯三唑醇和環(huán)丙唑醇在25～2 500 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 7～0.999 8。

表1 4種三唑類農(nóng)藥的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和最低定量限

2.3.2 方法的準確度和精密度

按1.2所述方法，分別在鰻鱺、日本對蝦、鮑魚及龍須菜空白樣品中添加不同濃度的三唑類混合標準溶液進行加標回收試驗，添加濃度分別為三唑酮0.4 μg /kg、4.0 μg/kg、8.0 μg /kg，三唑醇、聯(lián)苯三唑醇和環(huán)丙唑醇8 μg/kg、80 μg/kg、160 μg/kg，每個濃度水平重復(fù)6次。為了驗證方法的再現(xiàn)性，又進行了這三個濃度水平的日間加標回收試驗。結(jié)果分別見表2～表3，日內(nèi)平均回收率為78.8%～94.0%，相對標準偏差為1.48%～11.4%；日間平均回收率為79.1%～95.0%，相對標準偏差為1.92%～9.12%，均符合藥殘檢測技術(shù)要求。

表2 加標樣日內(nèi)平均回收率和相對標準偏差

表3 加標樣日間平均回收率和相對標準偏差

3 結(jié)論

本研究建立了水產(chǎn)品中4種三唑類農(nóng)藥三唑酮、三唑醇、聯(lián)苯三唑醇和環(huán)丙唑醇殘留的氣相色譜檢測方法。樣品選用乙腈作為提取液，石墨化碳黑-弗羅里硅土復(fù)合柱進行固相萃取，使樣品中蛋白質(zhì)、油脂和色素等雜質(zhì)得到有效凈化，前處理過程步驟少，縮短了樣品檢測周期，試劑用量少，檢測成本低，適合批量樣品的快速檢測。本研究對色譜分析條件進行了優(yōu)化，提高儀器對目標物的響應(yīng)，建立的分析方法靈敏度、準確度和精密度均符合藥殘檢測技術(shù)要求，可應(yīng)用于水產(chǎn)品中三唑類農(nóng)藥殘留的日常檢測。

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