鄭建欣，毛春芳

（1.福建省仙游縣醫(yī)院，福建 莆田 351200；2.福建省邵武市立醫(yī)院，福建 南平 354000）

三七始載于《本草綱目》，臨床應(yīng)用多為研末沖服。 丹參為常用中藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品［1］159，李時(shí)珍：“丹參，按《婦人明理論》云：四物湯……惟一味丹參散，主治與之相同。 ”［1］1204丹參、三七兩藥功效相近，常配伍使用，是中醫(yī)臨床上常用的藥對(duì)之一，具有“活血化瘀、理氣止痛”的功效，用于預(yù)防和治療冠心病、心絞痛，比如被列為國(guó)家臨床急救必備藥物之一的復(fù)方丹參滴丸，就是以丹參、三七為主要成分。學(xué)術(shù)界對(duì)于該藥對(duì)的研究由來(lái)已久，僅在萬(wàn)方數(shù)據(jù)知識(shí)平臺(tái)檢索到關(guān)于丹參、三七的文章就多達(dá)1 636篇，已有研究發(fā)現(xiàn)藥對(duì)不同的配伍比例對(duì)于成分的溶出量存在明顯的影響，以經(jīng)典方（丹參∶三七為 5∶3）丹參素的溶出量最高［2］，而在復(fù)方丹參片（丸、顆粒、膠囊、噴霧劑）中丹參∶三七為15∶4.7［3］。 中藥配方顆粒是以符合炮制規(guī)范的傳統(tǒng)中藥飲片為原料，通過(guò)現(xiàn)代制藥技術(shù)模擬家庭水煎煮模式，經(jīng)過(guò)提取、濃縮、制粒而成的中藥產(chǎn)品，其性味、功效與原中藥飲片一致，供臨床調(diào)配，即沖即服，與傳統(tǒng)中藥飲片使用相比，減少共煎的過(guò)程。傳統(tǒng)中藥湯劑煎煮是一個(gè)復(fù)雜的物理、化學(xué)反應(yīng)過(guò)程，單煎與合煎引起化學(xué)成分及含量變化都很大［4］，雖有許多臨床醫(yī)生及藥學(xué)工作者研究認(rèn)為配方顆粒的臨床療效值得肯定，但對(duì)中藥配方顆粒的即沖即服與合煎所產(chǎn)生化學(xué)成分影響的對(duì)比研究比較少。丹參、三七藥對(duì)在臨床上應(yīng)用廣泛，使用頻次高，丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、原兒茶醛、三七皂苷R1是丹參、三七制劑常用的質(zhì)量控制指標(biāo)［2-5］，該藥對(duì)的傳統(tǒng)飲片及配方顆粒的溶液與合煎液有效成分溶出的定性、定量分析，能為臨床更合理使用中藥配方顆粒提供數(shù)據(jù)參考，為其發(fā)揮更大的臨床效用提供新思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 丹參素（110855-200405）、丹酚酸B（111562-201615）、丹參酮Ⅰ（110867-200406）、丹參酮ⅡA（110766-200619）、原兒茶醛（110810-200205）、三七皂苷 R1（110745-200617）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。丹參、三七飲片及配方顆粒均由廣東一方制藥有限公司提供，經(jīng)廣東一方制藥有限公司質(zhì)量檢測(cè)中心鑒定均符合《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版）項(xiàng)下規(guī)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 Waters Xevo TQ-S型三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)Waters公司）；H-Class高效液相色譜儀包括在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器（美國(guó)Waters公司）；XP26百萬(wàn)分之一天平（梅特勒-托利多公司）；Milli-Q純水儀（默克股份有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 甲醇（色譜純，默克股份有限公司）；乙腈（色譜純，默克股份有限公司）；甲酸（色譜純，科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜分離采用Acquity UPLC HSS T3 column（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相 A：乙腈，流動(dòng)相B：0.1%的甲酸水，梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?0～2.29 min，13%～87%A；2.29～8 min，13%～28%A；8～9 min，28%～61%A；9～15 min，61%～90%A；流速 0.5 mL／min，柱溫 30 ℃，進(jìn)樣量2 μL。

2.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源（ESI），同時(shí)進(jìn)行正、負(fù)離子檢測(cè)，正離子模式下檢測(cè)的化合物為丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、三七皂苷R1；負(fù)離子模式下檢測(cè)的化合物為原兒茶醛、丹參素、丹酚酸B。工作參數(shù)設(shè)置為：離子源溫度500℃，錐孔電壓3.0 kV，霧化氣氮?dú)獾牧魉贋? 000 L／h，碰撞氣氬氣的流速為0.12 mL／min。掃描方式為MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m／z 295→277（丹參酮ⅡA）；m／z277→249（丹參酮Ⅰ）；m／z717→519（丹酚酸 B）；m／z137→108（原兒茶醛）；m／z197→135（丹參素）；m／z955→775（三七皂苷 R1）。

2.3 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、原兒茶醛、三七皂苷R1對(duì)照品適量，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。各對(duì)照品溶液由混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液用甲醇稀釋制備。

2.4 供試品溶液的制備

2.4.1 飲片合煎液 將丹參飲片與三七粗粉按照兩個(gè)配伍比例混合后，用10倍水量浸泡1 h后，煎煮2次，每次1 h，第二次煎煮加水量為8倍量水。過(guò)濾，合并兩次煎液加水補(bǔ)足至18倍量，即得。

2.4.2 飲片單煎液 分別稱取2份丹參飲片15 g，煎煮與樣品處理方法均同上，得兩份丹參單煎液后，分別稱取三七細(xì)粉4.7 g和9 g，分別將三七細(xì)粉加入丹參單煎液中，攪拌均勻，即得。

2.4.3 中藥配方顆粒合煎液 分別稱取飲片當(dāng)量丹參15 g配方顆粒與飲片當(dāng)量三七9 g配方顆粒，加18倍量熱水合煎20 min，過(guò)濾，加水補(bǔ)足至18倍量，即得。

2.4.4 中藥配方顆粒溶液 分別稱取飲片當(dāng)量丹參15 g配方顆粒與飲片當(dāng)量三七9 g配方顆粒，分別加18倍量熱水溶解，即得。

取上述7種供試品儲(chǔ)備液，分別精密吸取5 mL至20 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取丹參素、丹酚酸 B、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、原兒茶醛、三七皂苷R1系列混合對(duì)照品溶液各2 μL，在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定（色譜圖見(jiàn)圖1）。以峰面積（Y）對(duì)對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）進(jìn)行回歸，得回歸方程，見(jiàn)表1。

圖1 6個(gè)對(duì)照品的MRM質(zhì)譜圖

表1 6種對(duì)照品的回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 精密度試驗(yàn) 取丹參素、丹酚酸 B、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、原兒茶醛、三七皂苷R1系列混合對(duì)照品溶液各2 μL，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)定各對(duì)照品峰面積，結(jié)果顯示6種對(duì)照品的 RSD 分別為 1.1%、1.6%、1.0%、1.1%、1.7%、1.5%，表明儀器精密度良好。

2.6.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別精密吸取各供試品，按上述色譜條件在 0、4、8、12、24 h 分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示，丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、原兒茶醛、三七皂苷R1的RSD分別為1.3%、1.8%、1.6%、2.0%、1.2%、1.9%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn) 將飲片丹參、三七及配方顆粒丹參、三七，按“2.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液平行6份，按上述色譜條件，分別連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算含量，結(jié)果顯示，丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、原兒茶醛、三七皂苷R1含量的RSD分別為1.6%、1.2%、2.1%、1.8%、1.5%、1.2%，說(shuō)明方法重復(fù)性良好。

2.6.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的供試品溶液6份，精密加入丹參素、丹酚酸 B、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、原兒茶醛、三七皂苷R1系列混合對(duì)照品溶液各2 μL，按上述色譜條件，分別測(cè)定6種有效成分的峰面積，計(jì)算回收率，求得平均回收率分別為 93.57%、97.76%、94.8%、95.03%、98.71%、94.19%，RSD 分別為 1.7%、0.6%、1.8%、1.6%、0.7%、1.9%，說(shuō)明此方法回收率良好。

2.7 樣品含量測(cè)定結(jié)果 分別取各供試品液按實(shí)驗(yàn)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各樣品每克飲片中含丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、原兒茶醛、三七皂苷R1的量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 丹參、三七飲片及配方顆粒單煎及合煎中6種成分含量比較 μg／g

3 討 論

丹參中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的成分有一百多種，其有效成分主要分為脂溶性和水溶性兩類，其中水溶性成分丹酚酸A、丹參素、丹酚酸B、原兒茶醛是防治動(dòng)脈粥樣硬化、治療冠心病及抗氧化作用的主要有效成分；脂溶性成分丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA是抗菌消炎、抗腫瘤的主要有效成分，同時(shí)對(duì)心血管疾病有預(yù)防和保護(hù)作用［5-6］。三七中的三七總皂苷對(duì)循環(huán)系統(tǒng)作用效果顯著，尤其是在心血管疾病的治療應(yīng)用更為廣泛［7-8］。

研究結(jié)果顯示：由兩個(gè)配伍比例的飲片單、合煎液中丹參素、丹參酮Ⅰ合煎液的含量稍有提高；丹酚酸B、丹參酮ⅡA合煎液的含量未看出規(guī)律性變化；原兒茶醛合煎液的含量略有下降，但總的趨勢(shì)不太明顯。三七皂苷R1合煎液的含量明顯下降，這可能是由于合煎時(shí)采用粗粉而單煎時(shí)采用細(xì)粉，說(shuō)明三七入煎劑時(shí)采用傳統(tǒng)的細(xì)粉兌入法成分溶出率更高。

在丹參配方顆粒與傳統(tǒng)飲片煎煮比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)6種成分含量差異不大，僅丹參酮類成分稍高。中藥配方顆粒為水溶性提取物，在水中完全溶解，不存在受溶出量因素的影響，三七和丹參配方顆?；旌显偌逯螅⑼?、丹參酮ⅡA含量下降明顯，推測(cè)可能是脂溶性成分再煎煮過(guò)程中析出或破壞；丹酚酸B受熱后會(huì)轉(zhuǎn)化成丹參素和原兒茶醛。彭九嫚等［6］的研究表明丹參酚酸B隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)峰面積開(kāi)始下降，而丹參素的峰面積開(kāi)始增加，配方顆粒經(jīng)過(guò)合煎后，丹參素和原兒茶醛含量明顯提高，這可能由于再煎煮過(guò)程中受熱導(dǎo)致丹酚酸B含量降低，丹參素和原兒茶醛含量增加。

配方顆粒合煎后三七皂苷R1的含量提高，可能是由于三七配方顆粒為超微粉，經(jīng)加熱提取增加了三七皂苷R1的含量，而三七配方顆粒的溶液只是用熱水溶解，所以含量相對(duì)較少。

復(fù)方中藥是復(fù)雜的一個(gè)整體，通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮療效，合煎過(guò)程所伴隨復(fù)雜的物理、化學(xué)變化使得中藥有了發(fā)揮臨床療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是復(fù)方中藥制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)的難點(diǎn)和重點(diǎn)。丹參、三七藥對(duì)在臨床上主要用于心血管疾病的預(yù)防與治療，有研究發(fā)現(xiàn)丹參、三七單煎與合煎的薄層色譜斑點(diǎn)數(shù)及色澤存在一定的差異，表明成分的含量及種類有一定的差別［9］。所以，我們認(rèn)為從有效成分的含量變化考察，當(dāng)某些藥對(duì)或處方經(jīng)過(guò)合煎能提高有效成分的含量［10］，使用配方顆粒時(shí)應(yīng)該再煎煮或高溫燜；或者將一些常用的、有效成分溶出量明顯提高的經(jīng)典藥對(duì)直接制成免煎復(fù)方顆粒，可以提高中藥配方顆粒臨床使用合理性。但對(duì)于受熱易轉(zhuǎn)化分解的藥物，不能對(duì)藥對(duì)配方顆粒再進(jìn)行煎煮，否則由于延長(zhǎng)藥物的受熱時(shí)間導(dǎo)致化學(xué)成分和傳統(tǒng)煎煮藥對(duì)的化學(xué)成分不一致，因此，不同藥對(duì)之間或藥對(duì)不同的使用范圍應(yīng)該具體情況具體分析。

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