伍 娟 ，趙錦燕 ，洪振豐 ，李 煌

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)臨床技能教學(xué)中心，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350004；4.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

復(fù)方熊膽茵陳顆粒（批準(zhǔn)文號(hào)：閩藥制Z201100 07）是福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院的院內(nèi)制劑，獲得國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局的授權(quán)專利（ZL201210516 947.9）。方中含有熊膽粉、茵陳、山楂、澤瀉、白術(shù)及柴胡等中藥，具有清肝利濕、疏肝健脾的功效。課題組前期臨床研究表明復(fù)方熊膽茵陳顆粒治療非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）療效顯著，能明顯改善模型大鼠的肝臟脂肪變性和脂滴聚集情況，具有降血脂及治療脂肪肝的作用［1-4］。本研究旨在觀察復(fù)方熊膽茵陳顆粒對(duì)NASH大鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）表達(dá)的影響，以進(jìn)一步探討復(fù)方熊膽茵陳顆粒治療NASH的作用機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠60只，雄性，體質(zhì)量（180±20）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK（滬 2017-0005），批號(hào)：200700053 1494。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 復(fù)方熊膽茵陳顆粒的主要組成藥物購于福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂，采用水提醇沉法制備浸膏，加入輔料制得復(fù)方熊膽茵陳顆粒，每克相當(dāng)于生藥1.314 g；西利賓安購自江蘇中興藥業(yè)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 通用RT-PCR試劑盒（中國寶生物工程有限公司）；目的基因引物DNA（上海捷瑞生物工程有限公司合成）；TNF-α免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 APC 300電泳儀（美國Bio-Rad公司）；9600 PCR儀（美國PE公司）；水平電泳槽（美國BioRad公司）；DU-650蛋白核酸分析儀（美國Beckman公司）；凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物造模、分組及給藥 將60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只。空白組大鼠喂食基礎(chǔ)飼料，飲用清潔水；其余各組大鼠喂食高脂飼料（含10%豬油，90%基礎(chǔ)飼料）6周，每周1次后肢皮下注射40%CCL4花生油溶液（按照首次劑量5 mg／kg，以后3 mg／kg）制備非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型。造模成功后西利賓安組按0.02 g／（kg·d）予西利賓安灌胃，低劑量組、中劑量組、高劑量組分別按4.73、9.46、18.92 g／（kg·d）予復(fù)方熊膽茵陳顆粒灌胃，空白組和模型組予等量生理鹽水灌胃，灌胃給藥期間繼續(xù)予以高脂飼料喂養(yǎng)。各組大鼠均在每天上午9～11時(shí)進(jìn)行灌胃，1次／d，連續(xù)4周。

2.2 取材 灌胃干預(yù)4周后取材，取材前一晚禁食，取材當(dāng)天稱重后予3%戊巴比妥鈉以60 mg／kg腹腔注射麻醉，摘取肝右葉肝組織1 cm×1 cm×1 cm，用4%多聚甲醛固定，用于形態(tài)學(xué)檢測(cè)；再取肝左葉0.5～1 g肝組織放入液氮罐中，-80℃冰箱保存，用于PCR檢測(cè)及免疫組織化學(xué)分析。

2.3 觀察指標(biāo)及方法

2.3.1 HE染色 取肝右中央葉用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制備石蠟切片（厚度為4 μm），用蘇木素—伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織的病理改變。

2.3.2 肝組織TNF-α mRNA表達(dá) 采用RT-PCR法檢測(cè)肝組織中TNF-α mRNA表達(dá)。Trizol法提取肝組織總RNA，取1 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì) TNF-α 的引物，TNF-α：primer F GATCTCAAAG ACAACCAACTG，primer R CTGGTATGAAATGCAAA TCG；GAPDH：primer F ACAGCAACAGGGTGGTGGA C，primer R TTTGAGGGTGCAGCGAACTT。 采 用20 μL 體系，反應(yīng)條件：94 ℃變性 5 min；94 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃終末延伸10 min，得到PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳后凝膠成像系統(tǒng)分析。

2.3.3 肝組織TNF-α蛋白表達(dá) 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝組織中TNF-α的蛋白表達(dá)，應(yīng)用MoticMed 6.0圖像分析系統(tǒng)分析TNF-α免疫組織化學(xué)染色切片，以胞漿和胞膜呈棕黃色顆粒作為陽性表達(dá)的判斷標(biāo)準(zhǔn)，染色結(jié)果用灰度值進(jìn)行半定量分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 各組大鼠肝臟組織病理學(xué)分析 鏡下可見：① 空白組大鼠肝細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常，呈多邊形，細(xì)胞核位置居中。模型組大多數(shù)肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，視野中滿布大量脂肪空泡，范圍超過2／3，肝小葉邊界模糊，肝索結(jié)構(gòu)紊亂，伴有炎細(xì)胞浸潤，屬病理+++級(jí)。②西利賓安組鏡下少量脂肪空泡，范圍小于1／3，伴有少量炎細(xì)胞浸潤，屬于輕度脂肪肝，符合病理+級(jí)。③ 低劑量組視野中有1／3～1／2細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，匯管區(qū)伴有少量炎細(xì)胞浸潤，屬于中度脂肪肝，介于病理+～++級(jí)。④ 中劑量組視野中偶見脂肪空泡，受累細(xì)胞范圍約1／3，符合病理+級(jí)。⑤ 高劑量組肝小葉完整，肝細(xì)胞呈條索狀排列，視野中只有極少數(shù)脂肪空泡，累及肝細(xì)胞不足1／3，未達(dá)到病理+級(jí)。復(fù)方熊膽茵陳顆粒各劑量組較模型組均有明顯地減輕和好轉(zhuǎn)。見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織HE染色病理圖（×40）

3.2 各組大鼠肝組織TNF-α mRNA表達(dá)比較見圖 2、表 1。

圖2 各組大鼠肝組織中TNF-α mRNA凝膠電泳圖

3.3 各組大鼠肝組織TNF-α蛋白表達(dá)比較 見圖 3、表 1。

4 討 論

圖3 各組大鼠肝組織TNF-α免疫組化圖（×40）

表1 各組大鼠肝組織TNF-α mRNA及蛋白表達(dá)比較（x±s）

非酒精性脂肪性肝炎以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪樣變性，同時(shí)伴有炎癥反應(yīng)、組織學(xué)改變和持續(xù)的肝損傷為主要特征，NASH可進(jìn)一步發(fā)展為肝纖維化、肝硬化，對(duì)NASH的防治是阻止非酒精性脂肪性肝病持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵［5］。大多數(shù)NASH的病理進(jìn)程都伴隨著炎癥反應(yīng)的發(fā)生，這說明炎癥反應(yīng)和NASH的發(fā)病密切相關(guān)［6-9］，通過調(diào)控炎癥因子的表達(dá)可以達(dá)到控制和治療NASH的目的。在炎癥發(fā)生過程中，肝臟的固有免疫細(xì)胞被激活，釋放出大量的促炎因子TNF-α、白細(xì)胞介素-1β和白細(xì)胞介素-6等，炎癥因子之間互相促進(jìn)，產(chǎn)生所謂的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控，進(jìn)一步加重肝細(xì)胞損傷。TNF-α是一種具有多重效應(yīng)的炎癥因子，可通過誘導(dǎo)脂類和多肽介質(zhì)的產(chǎn)生誘發(fā)肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，激活中性粒細(xì)胞，促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡等途徑引起肝細(xì)胞損傷。肝臟中有著豐富的TNF-α受體，TNF-α可直接作用于肝組織引起肝損傷，通過抑制TNF-α則可減少肝細(xì)胞的凋亡和壞死［10］。多研究表明下調(diào)TNF-α的表達(dá)，能減輕肝臟病理學(xué)損傷程度，其機(jī)制可能與阻止肝臟炎癥反應(yīng)有關(guān)［11-14］。

西利賓安為臨床常用護(hù)肝藥，療效確切，因此本研究用西利賓安作為陽性對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)中HE染色顯示模型組肝細(xì)胞發(fā)生明顯脂肪變性，視野中滿布大量脂肪空泡，肝索結(jié)構(gòu)紊亂，伴有炎細(xì)胞浸潤，肝臟TNF-α mRNA及蛋白的表達(dá)較空白組均明顯升高（P＜0.05），說明模型組大鼠肝臟發(fā)生炎癥反應(yīng)，肝細(xì)胞損傷。通過4周復(fù)方熊膽茵陳顆粒的治療，HE染色顯示復(fù)方熊膽茵陳顆粒各劑量組肝細(xì)胞脂肪空泡明顯減少，肝脂肪變性及炎癥損傷明顯好轉(zhuǎn)；RT-PCR和免疫組化結(jié)果顯示，復(fù)方熊膽茵陳顆粒各劑量組肝臟TNF-α mRNA及蛋白的表達(dá)較模型組均明顯降低（P＜0.05），復(fù)方熊膽茵陳顆粒各組降低TNF-α的作用呈量效關(guān)系。提示復(fù)方熊膽茵陳顆粒能減輕NASH大鼠肝臟炎癥反應(yīng)，保護(hù)肝細(xì)胞，通過調(diào)控炎癥反應(yīng)為其治療NASH的機(jī)制之一。

綜上所述，復(fù)方熊膽茵陳顆粒通過降低TNF-α的表達(dá)，減少大鼠肝臟炎癥反應(yīng)的發(fā)生，減少肝細(xì)胞損傷。以上結(jié)果說明調(diào)控炎癥反應(yīng)是復(fù)方熊膽茵陳顆粒治療NASH的作用機(jī)制之一。但NASH發(fā)病原因復(fù)雜，因此仍需進(jìn)一步研究來闡明其作用機(jī)理。

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