李亞青，可 燕，蔣嘉燁，李漢清，劉佳琪，栗 源，干仲元

(上海中醫(yī)藥大學教學實驗中心，上海 201203)

內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-mesenchymal transition,EndMT)是內(nèi)皮細胞在特殊生理或病理條件下失去內(nèi)皮細胞特征，表達間質(zhì)細胞特征的過程，屬于上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的一種。其主要特性是細胞骨架發(fā)生變化，內(nèi)皮細胞間黏附力逐漸降低直至失去，內(nèi)皮細胞標志蛋白減少，間質(zhì)細胞標志蛋白及纖維細胞特異性蛋白增多[1]。近年來，越來越多的研究表明，多種疾病的發(fā)生、發(fā)展進程都涉及到EndMT，如動脈粥樣硬化[2]、心肌纖維化[3]、肺動脈高血壓[4]等各種心血管疾病。因此，尋找以EndMT為靶點的天然藥物具有非常重要的意義。

黃花烏頭[Aconitumcoreanum(H.Lév.)Raipaics]是毛茛科烏頭屬植物，塊根入藥，中藥名為關(guān)白附、白附子、竹節(jié)白附，具有祛風痰、逐寒濕、止痛的功效[5]。20世紀60年代至今，黃花烏頭的有效成分分離及藥理研究主要集中在生物堿如鹽酸關(guān)附甲素方面[6-7]，關(guān)于其多糖成分的研究很少。本課題組首次從黃花烏頭中分離并鑒定出1種均一多糖(Aconitum coreanum polysaccharides,ACP)，其結(jié)構(gòu)見Fig 1A。并且已驗證ACP在脂多糖誘導的巨噬細胞RAW炎癥模型中，可通過NF-κB信號途徑劑量依賴性地抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β、iNOS和IL-6的表達[8]。本研究擬通過建立轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)EndMT模型，觀察ACP 抑制EndMT的作用及相關(guān)機制。

1 材料

1.1細胞系HUVEC購自ATCC(ATCC-CRL-1730TM)。

1.2藥物與試劑黃花烏頭藥材(批號：150910)，購于上?？禈蛑兴庯嬈邢薰?；ACP為本課題組自制。TGF-β購于Peprotech公司；內(nèi)皮細胞生長因子(endothelial cell growth supplement,ECGS)購于Sciencell公司；肝素購于Biosharp公司；RIPA、PMSF，購于上海威奧生物科技有限公司；CD31抗體(ab64543)購自Abcam公司；α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)抗體(23081-1-AP)購自Proteintech公司；Smad2抗體(D43B4)、p-Smad2抗體(D27F4)、Smad3抗體、p-Smad3抗體(C25A9)，均購自美國Cell Signaling Technology公司；CCK-8檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；DMEM培養(yǎng)基(SH30021.01)購于HyClone公司；DPBS、胎牛血清(FBS)、胰酶，均購自美國Gibco公司。

1.3儀器超凈臺(蘇凈安泰)；顯微鏡(日本Olympus公司)；Galaxy 170S CO2培養(yǎng)箱(Eppendorf公司)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)；化學發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；Cellometer Mini細胞計數(shù)儀(Nexcelom)；酶標儀(Molecular devices)。

2 方法

2.1ACP的制備ACP的制備方法參見文獻[8]，經(jīng)高效液相測定含量為98%。用DPBS作為溶劑，超聲溶解，配制成10 g·L-1的母液，加藥前用DMEM培養(yǎng)基分別稀釋成所需濃度。

2.2HUVEC的培養(yǎng)HUVEC細胞復蘇，培養(yǎng)條件為37℃、95%濕度、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基為含10% FBS、肝素、ECGS的DMEM培養(yǎng)基，3～5 d后細胞融合度到80%～90%時，采用胰酶進行消化、離心、混懸操作，按照1 ∶3比例傳代。

2.3細胞分組與給藥模型建立：HUVEC分為5組，用濃度為0、1、5、10、20 μg·L-1的TGF-β刺激細胞，孵育72 h。藥物干預：HUVEC分為5組，為空白對照組(DMEM培養(yǎng)基)、模型組(10 μg·L-1TGF-β)、給藥組[10 μg·L-1TGF-β+ ACP(50、100、200 mg·L-1)]。孵育72 h。

2.4CCK-8細胞增殖毒性實驗將HUVEC消化、離心、混懸，加入到96孔板中，每孔100 μL，密度控制在每孔5×103個細胞，每個濃度設3個復孔，培養(yǎng)24 h，采用不同濃度的ACP分別干預HUVEC，36 h后加入CCK-8試劑，每孔10 μL，孵育4 h，450 nm處測定吸光度。

2.5劃痕實驗當HUVEC融合度到80%～90%時，接種到12孔板，貼壁培養(yǎng)12 h后，采用20 μL槍頭在12孔板內(nèi)垂直劃痕，用DPBS輕洗3次，按照“2.3”項下方法分組，無血清給藥處理24 h后，每組隨機選擇4個平行標記點，于顯微鏡下觀察細胞遷移情況，并計算細胞遷移距離：遷移距離d=(0 h劃痕的平均面積-24 h劃痕的平均面積)/劃痕長度。

2.6Westernblot實驗將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基棄去，用DPBS輕洗2遍，加入蛋白裂解液(RIPA ∶PMSF=50 ∶1)100 μL，冰上裂解5 min，刮板刮下蛋白收集到離心管中，超聲，離心，取上清液，考馬斯亮藍法蛋白定量，并由制備的標準曲線求出各樣本蛋白的最終濃度，調(diào)整總蛋白含量一致后，加入4×蛋白上樣緩沖液混合，95℃加熱10 min使充分變性。配膠，每孔15 μL進行10% SDS-PAGE凝膠電泳(80 V,30 min;120 V,1.5 h)，將蛋白以250 mA、2 h轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，奶粉封閉1 h，相應一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜。相應二抗孵育1 h，TBST洗膜后顯影，使用圖像分析軟件檢測各組蛋白的相對密度(以GAPDH為內(nèi)參)。

3 結(jié)果

3.1ACP含量測定ACP的提取率為0.05%，經(jīng)高效液相測定含量為98%(Fig 1)。

Fig 1 Structure (A) and HPLC (B) of ACP

3.2ACP對HUVEC生長活性的影響Fig 2的CCK-8檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，不同濃度ACP干預HUVEC 36 h后，細胞活性明顯增加(P<0.05)，提示ACP對HUVEC細胞的生長有促進作用。

3.3TGF-β誘導HUVECEndMT模型以不同濃度TGF-β誘導HUVEC EndMT發(fā)生(Fig 3)，當TGF-β濃度≥10 μg·L-1時，內(nèi)皮特異性標志物CD31蛋白表達明顯下降(P<0.05)，間質(zhì)細胞特異性標志物α-SMA蛋白表達明顯增加(P<0.05)。故選用TGF-β(10 μg·L-1)刺激72 h為造模條件。

3.4ACP對TGF-β誘導HUVEC遷移能力的影響Fig 4劃痕實驗結(jié)果顯示，模型組在給予10 μg·L-1TGF-β處理后，24 h內(nèi)細胞遷移率明顯增高，表明TGF-β可以促進細胞遷移；與模型組相比，ACP(50、100、200 mg·L-1)處理24 h內(nèi)細胞遷移率明顯降低，表明ACP可以抑制由TGF-β引起的細胞遷移增強，并有劑量依賴性。

Fig 2 Effects of ACP at various concentrations

*P<0.05vscontrol group

Fig 3 Effects of TGF-β on protein levels of CD31,

A:α-SMA, CD31 expressions were detected by Western blot; B: Density analysis of protein expression.*P<0.05vscontrol group.

3.5ACP對HUVECEndMT相關(guān)蛋白表達的影響TGF-β刺激HUVEC后，內(nèi)皮特異性標志物CD31蛋白表達明顯下降(P<0.05)，間質(zhì)細胞特異性標志物α-SMA蛋白表達明顯增強(P<0.05)。與模型組相比，TGF-β與ACP共培養(yǎng)可明顯抑制這種情況，且具有劑量依賴性(Fig 5)。

Fig 4 Effects of ACP on cell mobility tested by wound

A:ACP suppressed the transfer ability induced by TGF-β; B:Distance migrated of HUVECs.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β-treated cells.

Fig 5 Effects of ACP on expression of CD31, α-SMA in HUVECs induced by

A:ACP inhibited expression of CD31, α-SMA induced by TGF-β; B: Density analysis of CD31 and α-SMA.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β-treated cells.

3.6ACP對TGF-β/Smad2/3信號通路的影響為進一步探討ACP抑制EndMT的機制，測定了TGF-β誘導下Smad2/3及磷酸化Smad2/3的蛋白表達。Fig 6的Western blot 結(jié)果表明，HUVEC經(jīng)TGF-β誘導后，p-Smad2、p-Smad3表達明顯增強(P<0.05)；經(jīng)ACP處理后，p-Smad2、p-Smad3水平相比于模型組明顯下降(P<0.05)，提示ACP通過TGF-β/ Smad2/3途徑抑制EndMT。

Fig 6 Effects of ACP on expression of p-Smad2, p-Smad3 in HUVECs induced by

A: Western blot for protein levels of p-Smad2/3 and Smad2/3; B:Quantification of protein levels of p-Smad2/3 normalized to Smad2/3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β-treated cells.

4 討論

心血管疾病是目前人類致殘、致死的主要原因之一，器官纖維化則是多種心血管疾病不斷進展導致的終末階段，可引發(fā)嚴重并發(fā)癥，導致器官損傷，是目前臨床面臨的治療難關(guān)[9]。因此，抑制器官纖維化的發(fā)生、發(fā)展是治療心血管疾病的重要環(huán)節(jié)，對降低心血管疾病的致死風險具有重要意義。近年來研究表明，EndMT和心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，EndMT可促進內(nèi)皮細胞向纖維樣細胞轉(zhuǎn)化，形成器官纖維化[10]，最終導致動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病等心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展[11]。因此，尋找以EndMT為靶點的天然藥物可能為防治心腦血管疾病提供新的臨床治療思路。

多糖是具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化等多種生物學活性的天然高分子聚合物，廣泛存在于動植物和微生物中，是近幾年藥物領域研究的熱點。黃花烏頭多糖有抗氧化、抗癌作用，我們前期從中分離純化的多糖ACP具有較好的抗炎作用。在此基礎上，本研究建立TGF-β誘導的HUVEC EndMT模型，考察ACP對EndMT過程的干預作用。結(jié)果顯示，TGF-β誘導能明顯增加細胞遷移能力，降低內(nèi)皮細胞特異性標志蛋白CD31表達，增加間質(zhì)細胞特異性標志蛋白α-SMA的表達，ACP能明顯逆轉(zhuǎn)這一過程，且具有劑量依賴性。

EndMT過程涉及了多個調(diào)節(jié)因子，其中TGF-β被認為是誘導EndMT發(fā)生的最明確的信號因子[12]。首先，TGF-β配體與內(nèi)皮細胞膜上的TGF-β Ⅱ型絲氨酸/蘇氨酸受體(TβRⅡ)結(jié)合形成異四聚體，活化跨膜I型受體使其磷酸化，激活TGF-β/Smad信號通路，使其下游細胞質(zhì)中Smads家族的Smad2 和Smad3蛋白磷酸化形成p-Smad2/3，隨后p-Smad2/3與通用型Smad4 形成復合物，轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，這些雜聚肽Smad 復合體入核后，通過與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用來調(diào)節(jié)Snail、Twist1 和Slug核內(nèi)特異靶基因的轉(zhuǎn)錄應答[13]。本研究結(jié)果表明，經(jīng) TGF-β誘導細胞72 h后，p-Smad2/3表達明顯上調(diào)，ACP干預后可明顯抑制p-Smad2/3表達。提示ACP對TGF-β誘導EndMT 有保護作用，其機制可能與抑制Smad2、Smad3磷酸化激活有關(guān)，關(guān)于Snail、Twist1 和Slug等核內(nèi)靶基因指標的表達情況還有待進一步研究。

此外，既往研究證實，炎癥和EndMT有緊密聯(lián)系，Mahler等[14]的研究證明，炎性細胞因子可通過Akt/NF-κB通路，誘導胚胎和成年瓣膜內(nèi)皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化。張利霞等[15]研究提示，高糖誘導小鼠腎小管上皮細胞EMT可能是通過激活NLRP3炎癥小體，從而增加IL-1β分泌實現(xiàn)的。本課題組已經(jīng)在體外證實了黃花烏頭均一多糖ACP良好的抗炎效果，下一步我們也將對ACP是否能抑制炎癥誘導的EndMT進行深入研究。

綜上所述，本實驗對ACP的研究為心血管疾病的新藥開發(fā)或者輔助藥物開發(fā)提供了一定的實驗依據(jù)，為研究心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展機制提供了一些新思路。

[1] Pinto M T,Covas D T,Kashima S,et al.Endothelial mesenchymal transition:comparative analysis of different induction methods[J].BiolProcedOnline,2016,18(1):10-8.

[2] 李紅蓉,秘紅英,孫 穎,等.內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化在動脈粥樣硬化中的研究進展[J].中國藥理學通報,2017,33(10):1338-41.

[2] Li H R,Mi H Y,Sun Y,et al.Research progress of endothelial mesenchymal transition in atherosclerosis[J].ChinPharmacolBull,2017,33(10):1338-41.

[3] Zhou X,Chen X,Cai J J,et al.Relaxin inhibits cardiac fibrosis and endothelial-mesenchymal transition via the Notch pathway[J].DrugDesDevTher,2017,11:1159-71.

[4] 張衛(wèi)芳,熊愛珍,吳衛(wèi)華,等.肺動脈高壓時肺血管內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)miRNAs網(wǎng)絡調(diào)控的生物信息學分析[J].中國藥理學通報,2016,32(9):1294-300.

[4] Zhang W F,Xiong A Z,Wu W H,et al.MicroRNAs integrates pathogenic signaling to control endothelial-mesenchymal transition in pulmonary hypertension: results of a network bioinformatic approach[J].ChinPharmacolBull,2016,32(9):1294-300.

[5] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編輯委員會.中華本草(精選本):上冊[M].上海:上?？茖W技術(shù)出版社,1996.

[5] The state administration of traditional Chinese medicine《Chinese materia medica》editorial board. Chinese materia medica(JingXuanBen):volume one[M].Shanghai: Shanghai publisher of Science and Technology,1996.

[6] 楊萌萌,范新榮,蔡 琳,等.鹽酸關(guān)附甲素抗心律失常研究進展[J].心血管病學進展,2013,34(5):660-4.

[6] Yang M M,Fan X R, Cai L, et al. Research progress of Guanfu base A about antiarrhythmia[J].AdvCardiovascDis,2013,34(5):660-4.

[7] 陸家鳳,可 燕,蔣嘉燁, 等.鹽酸關(guān)附甲素對大鼠血管舒縮功能的影響及其機制[J].中國藥理學通報,2012,28(7):952-5.

[7] Lu J F,K Y,Jiang J Y,et al.Effects and machanisms of Guanfu base-A on vasomotion of rats[J].ChinPharmacolBull,2012,28(7):952-5.

[8] Li X J,Jiang J Y,Shi S S,et al. ARG-II type polysaccharide purified from Aconitum coreanum alleviates lipopolysaccharide-induced inflammation by inhibiting the NF-kB signal pathway[J].PLoSOne,2014,9(6):e99697-711.

[9] Chaturvedi R R,Herron T,Simmons R,et al.Passive stiffness of myocardium from congenital heart disease and implications for diastole[J].Circulation,2010,121(8):979-88.

[10] Bao M H,Feng X,Zhang Y W,et al.Let-7 in cardiovascular diseases, heart development and cardiovascular differentiation from stem cells[J].IntJMolSci,2013,14(11):23086-102.

[11] Favero G,Paganelli C,Buffoli B,et al. Endothelium and its alterations in cardiovascular diseases: life style intervention[J].BiomedResInt,2014,2014(2):801896-924.

[12] Leask A. Getting to the heart of the matter[J].CircRes,2015,116(7):1269-76.

[13] Ji Y,Dou Y N,Zhao Q W,et al.Paeoniflorin suppresses TGF-beta mediated epithelial-mesenchymal transition in pulmonary fibrosis through a Smad-dependent pathway[J].ActaPharmacolSin,2016,37(6):794-804.

[14] Mahler G J,Farrar E J,Butcher J T. Inflammatory cytokines promote mesenchymal transformation in embryonic and adult valve endothelial cells[J].ArteriosclThromVas,2013,33(1):121-30.

[15] 張利霞,弓曉麗,劉 虹.NLRP3炎癥小體在高糖誘導小鼠腎小管上皮細胞EMT中的作用[J].長治醫(yī)學院學報,2017,31(1):16-9.

[15] Zhang L X,Gong X L,Liu H.Role of NLRP3 inflammsome in epithelial-mesenchymal transition induced by high glucose in mouse renal tubular epithelial cell[J].JChangzhiMedColl,2017,31(1):16-9.