吳 莉, 邰 宇,胡珊珊, 王 瑞, 張 梅, 陶 娟, 周偉杰, 汪慶童, 魏 偉

(安徽醫(yī)科大學臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點實驗室，安徽抗炎免疫藥物協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230032)

細胞增殖是多細胞生物體生長、發(fā)育、繁殖以及遺傳的基礎，是生物體的重要生命特征。檢測細胞在培養(yǎng)基或組織中的生長速率，對于細胞生長和分化研究至關重要，在藥物開發(fā)過程中也常被用于評估藥物的毒性和對細胞生長的抑制情況。細胞增殖的檢測是一定數(shù)量的細胞經(jīng)過一段時間的分裂后所產(chǎn)生的細胞數(shù)量，反映細胞生長的速度。目前常用的細胞增殖檢測方法有兩種，一種是直接測定DNA含量的變化，經(jīng)典方法為胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)參入法；另一種是間接地檢測細胞線粒體功能，通過細胞的代謝強弱反映增殖活躍度，常用檢測方法為四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法和細胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8, CCK-8)等。3H-TdR參入法是將3H標記的DNA前體物質(zhì)胸腺嘧啶核苷加入到細胞培養(yǎng)體系中，當細胞增殖時，DNA大量合成，3H-TdR即會參入到細胞的DNA分子中，對于放射量的檢測可以判斷3H-TdR參入量的多少，反映細胞增殖情況[1]。MTT為一種黃色染料，活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶解的藍紫色甲臜結(jié)晶，并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。用二甲基亞砜溶解甲臜，測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量[2]。CCK-8的原理跟MTT相似，該試劑中主要成分是一種水溶性的四唑鹽(WST-8), WST-8在電子載體(1-methoxy PMS)的作用下，被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物。生成的甲臜物的數(shù)量與活細胞數(shù)量成正比，可以利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析，不同之處在于CCK-8法生成的甲臜是水溶性的，可以直接檢測[3]。然而，如果能直接觀察細胞增長的數(shù)量，則更為準確和簡便。隨著現(xiàn)代細胞學技術的發(fā)展，細胞拍攝速度和軟件分析功能不斷被提高，近年來出現(xiàn)的高內(nèi)涵細胞成像分析系統(tǒng)由全自動高速顯微成像、全自動圖像分析、數(shù)據(jù)管理3個部分組成，可以實現(xiàn)高通量快速的細胞顯微成像，短時間內(nèi)完成96孔板的拍攝，再進行所有細胞的同步分析，可以精確地計算出細胞數(shù)量[4]。

滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LSs)是貼壁生長的梭形細胞，類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)患者關節(jié)中，滑膜細胞在腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)等促炎細胞因子的刺激下呈類腫瘤樣過度增殖。甲氨蝶呤(methotrexate, MTX)等緩解病情的抗風濕藥具有很強的免疫抑制作用，是臨床上治療RA的主要藥物，可以明顯抑制滑膜細胞增殖[5]。本實驗運用高內(nèi)涵細胞成像系統(tǒng)檢測滑膜細胞增殖情況，并與傳統(tǒng)的3H-TdR參入法、MTT法和CCK-8法進行比較，為細胞增殖檢測提供新的方法。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器DMEM(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Hyclone公司)；青霉素-鏈霉素溶液、臺盼藍、胰酶、Hoechst 33342(碧云天生物技術研究所)；氚標記的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)(中國科學院上海應用物理研究所)；2, 5-二苯基噁唑(PPO)、1, 4-雙(5-苯基-2-噁唑基)苯(POPOP)、MTT和DMSO(美國Sigma公司)；MTX注射液(25 g·L-1)(美國輝瑞制藥有限公司)；CCK-8試劑盒(日本同仁化學研究所)；TNF-α(美國PeproTech公司)。Napco-6100型CO2細胞培養(yǎng)箱(美國杜邦公司)；BioTek ELx808 酶標儀(美國BioTek公司)；LS6500型液體閃爍計數(shù)儀(美國Beckman公司)；Image Xpress Micro 4型高內(nèi)涵細胞成像系統(tǒng)(美國Molecular Devcies公司)。

1.2方法

1.2.1大鼠FLSs的分離和培養(yǎng) 1.2 g·L-1新潔爾滅溶液浸泡消毒大鼠，超凈臺中剪開膝關節(jié)正中皮膚，暴露出膝關節(jié)位置，繼續(xù)向下慢慢剪開筋膜組織，分離出平滑光亮的關節(jié)囊。用眼科剪剪斷韌帶，剝離暴露出完整的關節(jié)囊。沿著軟骨面剪下關節(jié)軟組織，剔除脂肪、纖維等，放入D-Hank’s液(不含Ca2+、Mg2+，含青霉素200 kU·L-1、鏈霉素200 mg·L-1)中反復漂洗，轉(zhuǎn)入DMEM中，剪成1～2 mm3小塊，用巴士吸管吸取組織均勻貼于培養(yǎng)瓶(預先用20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液濕潤)底壁，加入2 mL培養(yǎng)液，瓶底朝上，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱貼壁6 h后，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)液覆蓋組織塊，每隔2 d換液1次，當組織塊四周爬滿細胞后輕輕剔除組織，原瓶消化，繼續(xù)培養(yǎng)傳代，取第3～8代FLSs用于增殖檢測。

1.2.23H-TdR參入法 0.25 g·L-1胰蛋白酶消化傳代，用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋細胞至2×107·L-1，每孔100 μL接種至96孔培養(yǎng)板中，貼壁過夜，給予TNF-α(20 μg·L-1)刺激FLSs增殖，分別用不同濃度MTX(10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol·L-1)作用，加培養(yǎng)液至每孔終體積200 μL，培養(yǎng)48 h。終止培養(yǎng)前6 h，每孔加入20 μL3H-TdR(1 mCi·L-1)，培養(yǎng)結(jié)束后，消化細胞，收集細胞至玻璃纖維濾紙上，生理鹽水洗滌去游離的3H-TdR，自然晾干濾紙，加入4 mL閃爍液(4 g PPO和0.4 g POPOP溶于1 L二甲苯中，避光保存)，用液閃儀測其放射性，每組設8個復孔，實驗重復3次。

1.2.3MTT法 FLSs鋪板給藥方法同3H-TdR參入法，細胞培養(yǎng)48 h，終止培養(yǎng)前6 h，每孔加入5 g·L-1MTT 20 μL，培養(yǎng)結(jié)束后吸棄上清，每孔加入120 μL DMSO，震蕩30 s，在酶標儀570 nm處檢測吸光度(absorbance，A)值，每組設8個復孔，實驗重復3次。

1.2.4CCK-8法 FLSs鋪板給藥方法同3H-TdR參入法，細胞培養(yǎng)48 h，終止培養(yǎng)前4 h，每孔加CCK試劑10 μL，避光，在細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，期間隨時利用酶標儀檢測450 nm處吸光度A值，每組設8個復孔，實驗重復3次。

1.2.5高內(nèi)涵細胞成像 FLSs鋪板給藥方法同3H-TdR參入法，細胞培養(yǎng)48 h，用生理鹽水清洗細胞2遍，每孔加50 μL的臺盼藍溶液染色3 min，倒置顯微鏡觀察拍照，計算死亡細胞百分比，洗棄臺盼藍液體，每孔加50 μL的Hoechst 33342(10 mg·L-1)避光染色10 min后棄去，加入PBS后用高內(nèi)涵細胞成像系統(tǒng)拍照，物鏡選擇10倍，像素選擇2，每孔拍攝16張圖片，可以完整記錄整孔細胞。細胞數(shù)量分析：測量視野中最大和最小的細胞核直徑，設定軟件識別細胞的直徑范圍，挑選熒光最強和最弱的細胞，測量熒光強度值，減去背景熒光強度，設定熒光強度的檢測范圍，通過調(diào)整此兩個參數(shù)圈出所有細胞，選擇模塊分析細胞總數(shù)，導出結(jié)果至Excel表格。

2 結(jié)果

2.13H-TdR參入法檢測MTX對TNF-α誘導FLSs增殖的抑制作用96孔板接種FLSs數(shù)量為2×103個，給予TNF-α(20 μg·L-1)刺激細胞增殖，不同濃度MTX(10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol·L-1)抑制細胞增殖，在核醫(yī)學教研室專用超凈臺中每孔細胞中加入3H-TdR，培養(yǎng)結(jié)束消化細胞，用抽濾泵將細胞收集在玻璃纖維濾紙片上，晾干后加入閃爍液上機計數(shù)，測定放射性cpm值)。如Fig 1所示，與文獻報道相符，TNF-α明顯升高細胞的cpm值，未刺激對照細胞cpm值為(3 139±1 663)，TNF-α組細胞cpm值為(9 900±3 228)，MTX體外給藥組的cpm值分別為(9 426±4 108)、(7 430±2 723)、(6 798±2 295)、(4 875±2 289)、(3 237±1 478)、(2 684±1 647)。1 nmol·L-1MTX即可觀察到明顯增殖抑制作用(P<0.05)，提示3H-TdR參入法檢測增殖敏感性高，但是數(shù)據(jù)離散程度較大，標準差達到均值的32.61%～61.36%，可能與細胞消化和轉(zhuǎn)移至濾紙是否充分、抽濾過程中游離3H-TdR洗脫程度差異、在閃爍液中的溶解情況不同等有關。

Fig 1 3H-TdR incorporation assay detects inhibitory effect of MTX on proliferation of FLSs induced by TNF-α

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsTNF-α group

2.2MTT法檢測MTX對TNF-α誘導FLSs增殖的抑制作用96孔板細胞體外刺激給藥后，加入MTT，線粒體將MTT還原成甲臜，用DMSO溶解后檢測A值。Fig 2結(jié)果顯示，陰性對照組細胞A值為(0.913±0.163)，TNF-α促進甲臜的產(chǎn)生，A值為(1.235±0.178)，MTX體外給藥組的A值分別為(1.180±0.168)、(1.123±0.156)、(1.071±0.136)、(1.044±0.145)、(0.932±0.157)、(0.914±0.109)。10 nmol·L-1MTX可觀察到明顯增殖抑制作用(P<0.01)，提示MTT法檢測的敏感性較3H-TdR參入法低，但是數(shù)據(jù)離散程度較小，標準差為均值的11.9%～17.8%。

2.3CCK-8法檢測MTX對TNF-α誘導FLSs增殖的抑制作用CCK-8法在MTT的基礎上進行了改進，產(chǎn)生的甲臜不用DMSO溶解，而可以直接檢測，對細胞影響較少，可以反復檢測不同時間的A值。實驗發(fā)現(xiàn)，加入CCK-8 4 h后，對照細胞孔檢測得到的A值為(0.574±0.142)，TNF-α刺激孔細胞的A值升高至(1.206±0.209)， MTX濃度從低至高體外給藥分別使FLSs的A值為(1.192±0.260)、(1.112±0.191)、(1.017±0.243)、(0.958±0.210)、(0.798±0.179)和(0.677±0.223)，各組A值大小均在CCK-8試劑盒的檢測靈敏范圍內(nèi)(Fig 3)。此方法檢測到10 nmol·L-1MTX對炎性FLSs增殖的抑制作用，靈敏度與MTT法相似，A值標準差在17.15%～32.88%之間。

Fig 2 MTT assay detects inhibitory effect of MTX on proliferation of FLSs induced by TNF-α

##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsTNF-α group

Fig 3 CCK-8 kits assay detects inhibitory effect of MTX on proliferation of FLSs induced by TNF-α

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsTNF-α group

2.4高內(nèi)涵細胞成像法檢測MTX對TNF-α誘導FLSs增殖的抑制作用細胞給藥處理48 h后進行臺盼藍染色，高內(nèi)涵細胞成像系統(tǒng)拍照，算出各孔死細胞數(shù)量(死細胞呈藍色)，臺盼藍染色見Fig 4，正常細胞、TNF-α刺激的細胞和MTX 10-10mol·L-1給藥組細胞死亡率較少，其他給藥組有少量細胞死亡。洗去臺盼藍染料，再進行Hoechst 33342染色，細胞核染上藍色熒光，高內(nèi)涵細胞成像系統(tǒng)拍照，如Fig 5所示，用軟件分析出每孔的細胞總數(shù)，減去臺盼藍染色細胞數(shù)，即為活細胞數(shù)量。根據(jù)測量和調(diào)整，最后設定FLSs細胞核大小為8～20 μm，熒光強度高于局部背景熒光2000graylevels，通過A圖和B圖的對比，確定所有細胞均選中(Fig 6)，選擇模塊，分析細胞數(shù)量。結(jié)果顯示，96孔板每孔接種2 000個FLSs，在含5%胎牛血清的DMEM體系中培養(yǎng)48 h，對照組細胞增長為(2 910±772.2)個，TNF-α刺激組每孔細胞為(6 063±1 011)個，MTX給藥組細胞數(shù)分別為(5 428±687.0)、(5 331±786.8)、(5 188±859.3)、(3 714±762.4)、(2 623±640.7)和(1 995±479.7)個。與3H-TdR參入法相似，1 nmol·L-1MTX即可檢測到明顯的增殖抑制作用(P<0.05，F(xiàn)ig 7)，靈敏度較高，且組內(nèi)數(shù)據(jù)的離散程度較小，標準差為均值的12.66%～26.54%。

Fig 4 FLSs trypan blue staining

A: Control; B: TNF-α; C: TNF-α +MTX 0.1 nmol·L-1; D: TNF-α +MTX 1 nmol·L-1; E: TNF-α +MTX 10 nmol·L-1; F: TNF-α+MTX 0.1 μmol·L-1; G: TNF-α+ MTX 1 μmol·L-1; H: TNF-α+ MTX 10 μmol·L-1. Arrows indicate trypan blue staining cells, implying the death of cells.

Fig 5 High content cell imaging system images 96-well of FLSs

A：Control;B: TNF-α;C: TNF-α+MTX;D: TNF-α+MTX 1 nmol·L-1；E：TNF-α+MTX 10 nmol·L-1；F：TNF-α+MTX;G: TNF-α+MTX 1 μmol·L-1；H：TNF-α+MTX 10 μmol·L-1. The nuclei were stained with Hoechst 33342 in blue. 16 photographs were taken with 20× objective lens each well. The cells were observed after stacking and counted by software.

Fig 6 The appropriate parameters set to select all cells for analysis

A: The (×10) objective lens photographed cell photos; B: All the objects that would be analyzed after setting the test parameters. All cells could be selected when the size of FLSs was measured between 8 μm to 20 μm while fluorescence intensity was higher than background fluorescence 2000 graylevel.

Fig 7 High content cell imaging detects inhibitory effect of MTX on proliferation of FLSs induced by TNF-α

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsTNF-α group

3 討論

細胞增殖檢測廣泛應用于分子生物學、遺傳學、腫瘤生物學、免疫學、藥理和藥代動力學等研究領域。細胞增殖是細胞經(jīng)過DNA復制倍增、RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成，而進行的分裂系列過程，主要是細胞數(shù)量發(fā)生了變化。尋找簡單準確的增殖檢測方法尤為重要。本實驗以FLSs貼壁細胞為研究對象，比較了幾種常用的細胞增殖檢測方法。目前，主要有兩種用于檢測細胞增殖能力的方法：一種是直接的方法，通過直接測定進行分裂的細胞數(shù)來評價細胞的增殖能力。另一種是間接的方法，即細胞活力檢測方法，通過檢測樣品中健康細胞的數(shù)目來評價細胞的增殖能力。顯然，細胞活力檢測法并不能最終證明檢測樣品中的細胞是否在增殖。

用于檢測細胞增殖能力最經(jīng)典的方法是用3H-TdR處理細胞，再檢測DNA鏈中氚含量。若細胞具有增殖能力，DNA合成過程中將會采用3H-TdR作為合成原料，因此，檢測細胞DNA鏈內(nèi)標記核苷酸的量可判斷細胞是否進行DNA的合成。3H-TdR參入法較客觀、敏感度強、細胞用量少、結(jié)果可靠，但所用試劑含有同位素，具有放射性，3H-TdR因為其生物學活性，一旦進入人體會被細胞用于DNA合成，造成內(nèi)輻射，從而對實驗人員具有一定的危害。細胞抽濾至玻璃纖維濾紙上后需要徹底洗去游離的3H-TdR，否則影響最終檢測值。濾紙需要晾干后加入閃爍液上機檢測，該方法操作復雜，耗時較長[6]。并且目前放射性試劑管制嚴格，不易購買，此方法難以開展。BrdU和EdU等也為胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細胞增殖時期代替胸腺嘧啶滲入正在復制的DNA分子，通過檢測EdU標記反映細胞的增殖情況。

在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT形成的結(jié)晶量與細胞數(shù)成正比，從而可以對細胞的活力、增殖與凋亡情況進行檢測。該法所用試劑少，儀器簡單，耗時少，出結(jié)果快。然而多個研究報道，細胞內(nèi)MTT的代謝除依賴于線粒體功能以外，也與非線粒體酶、溶酶體和核內(nèi)體有關[7]。一些藥物可以直接與MTT相互作用，例如維生素C和維生素A，多種植物提取物如多酚類的白藜蘆醇和黃酮類的槲皮素、毛地黃黃酮和山柰酚等，影響實驗結(jié)果。還有一些藥物可以影響線粒體脫氫酶活性，例如氯喹和干擾素等可以抑制酶活性，因而造成實驗結(jié)果的假陰性，相反，染料木黃酮可以促進酶活性而造成實驗結(jié)果假陽性。此外，阿霉素等可以使細胞產(chǎn)生大量自由基，促進MTT轉(zhuǎn)化。甲臜顆粒不易溶解，導致敏感性低于同位素法，因此MTT在檢測細胞活力時存在一定的局限性[8]。

CCK-8被線粒體脫氫酶轉(zhuǎn)化成可溶性甲臜，不需要吸出培養(yǎng)液再加入有機溶劑溶解，可以減少步驟和誤差，其重復性優(yōu)于MTT，對細胞毒性較小，檢測后細胞還可重復利用，具有很好的實用性，尤其適用于懸浮細胞，高通量藥物篩選。然而CCK-8形成甲臜的量隨時間延長而增多，測出的A值不斷升高，因此在實驗操作時，反應時間必須嚴格控制，生成甲臜的量太多，可能會超出酶標儀的讀數(shù)范圍，甲臜的量太少，則不能充分反映細胞的活力。由于CCK-8也是由線粒體脫氫酶代謝，因此任何與CCK-8本身或線粒體脫氫酶有作用的藥物均影響檢測結(jié)果[9]。CCK-8試劑價格較為昂貴，成本高，所以更適于靈敏度要求高、分離純化不易、樣品量少的天然產(chǎn)物提取物的活性檢測。相同原理的方法還有MTS和WST-1法等。

直接計數(shù)給藥后細胞數(shù)量是檢測增殖程度的標準，但是，普通倒置顯微鏡很難對整個細胞培養(yǎng)板進行拍照和分析。高內(nèi)涵分析技術是一種基于成像的單細胞水平的多參數(shù)細胞分析方法。高內(nèi)涵細胞成像系統(tǒng)具有磁懸浮自動載物臺，可以對整板細胞進行快速成像。對細胞核進行熒光染色后清楚地標記出所有細胞核，且應用細胞毒性小的活細胞染料如Hoechst 33342等，可動態(tài)觀察細胞增殖分裂情況。后繼的分析系統(tǒng)具有細胞計數(shù)等模塊，可以方便準確的選中所有細胞進行多參數(shù)分析，包括細胞數(shù)量、細胞核面積大小、細胞核熒光染色強度，以及分裂增殖后細胞的形態(tài)和表型等，是在保持細胞結(jié)構(gòu)和功能完整性的前提下，同時檢測被篩樣品對細胞形態(tài)、生長、分化、遷移、凋亡、毒性、代謝途徑及信號轉(zhuǎn)導各個環(huán)節(jié)的影響，在單一實驗中獲取大量與基因、蛋白及其他細胞成分相關的信息，確定待測藥物生物活性和潛在毒性的過程。此方法準確度高，數(shù)據(jù)可靠，實驗步驟方便，細胞核熒光染料價格低廉，在藥物活性的高通量篩選中運用逐漸增多[10]。然而，由于細胞成像的限制，對于貼壁細胞的檢測優(yōu)于懸浮細胞。該系統(tǒng)設備昂貴，也局限了其在細胞增殖檢測中的應用。

上述細胞增殖和活力的檢測方法都得到了驗證，選擇何種檢測方法取決于實驗條件、待測藥物的性狀、細胞的特點和檢測目的等。高內(nèi)涵細胞成像檢測方法為一種更準確的新型檢測細胞增殖實驗方法，有望在細胞動力學和藥物活性分析中得到更為廣泛的關注。

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