薛朝軍，李 倩，支旭然，李 穎，李 宵，董占軍,

(1. 河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，河北 石家莊 050017；2. 河北省人民醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石家莊 050051)

甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)是一種葉酸拮抗劑，通過抑制二氫葉酸還原酶，阻止癌細(xì)胞分裂，用于治療急性白血病[1]、乳腺癌、絨毛上皮癌等癌癥。低劑量甲氨蝶呤用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、硬皮病等自身免疫性疾病[2]。由于缺乏特異的毒性生物標(biāo)志物，甲氨蝶呤副作用的發(fā)生往往是不可預(yù)知的，應(yīng)根據(jù)患者疾病的需求選擇適當(dāng)劑量的氨甲喋呤并監(jiān)測血藥濃度。

左乙拉西坦(levetiracetam，LEV)在臨床上主要用于治療各種癲癇，其機(jī)制可能是通過選擇性地抑制癲癇樣放電，以及與突觸囊泡白蛋白2A結(jié)合，對突觸前突觸囊泡釋放神經(jīng)遞質(zhì)產(chǎn)生影響[3]，具體機(jī)制目前尚不清楚。左乙拉西坦臨床用于4歲以上兒童癲癇患者部分性發(fā)作的加用治療。左乙拉西坦副作用較小，目前臨床上進(jìn)行了左乙拉西坦治療自閉癥[4]、頭痛[5]等疾病研究。加拿大衛(wèi)生部提示，左乙拉西坦和甲氨蝶呤相互作用具有潛在風(fēng)險(xiǎn)。這兩種藥物合用可能會(huì)導(dǎo)致血液中甲氨蝶呤濃度升高，引起可能是致死性(包括突發(fā)急性腎衰竭)的嚴(yán)重副作用。文獻(xiàn)報(bào)道，甲氨蝶呤和左乙拉西坦都是p-gp的底物[6-7]。由于在甲氨蝶呤和左乙拉西坦在臨床上存在合用的可能性，而這兩藥合用后可能會(huì)發(fā)生相互作用，因此開展此研究，以期為臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1藥品與試劑甲氨蝶呤(索萊寶公司，純度：99%)；左乙拉西坦(J&K Scientific Ltd，純度：99%)；氨基蝶呤(上海源葉生物有限公司，純度：99%)；甲醇、乙腈、三蒸水等。

1.2儀器Shimadzu LC-30AD型超高效液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司)；AB Sciex Triple Quad 5500型三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB公司)；Hettich Zentrifuge 1602型高速低溫離心機(jī)(德國Hettich公司)；KQ3200E 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；AB204-S型標(biāo)準(zhǔn)型的分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司) ；XW-80A型旋渦混合器(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；Milli-Q純水儀(默克化工技術(shù)有限公司)等。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康♂ SD大鼠，體質(zhì)量(250±20) g，由河北醫(yī)科大學(xué)中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)合格證號:1707095，使用許可證號：SCXK(冀)2013-10003。

2 方法

2.1色譜條件色譜柱：Waters ACQUITY?UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；柱溫：40℃；自動(dòng)進(jìn)樣器：4℃；流動(dòng)相：乙腈(B)、含0.1%甲酸水(A)，梯度洗脫(0 min，5% B; 3.5 min，95% B；4 min，95% B；4.2 min，5% B；4.5 min，stop)；時(shí)間：4.5 min；流速：0.2 mL·min-1；進(jìn)樣量：2 μL。

2.2質(zhì)譜條件離子化源：電噴霧離子源(ESI)，正離檢測；氣簾氣壓力為30 kPa；碰撞氣壓力是8 kPa；噴霧電壓是5 500 V；去溶劑溫度為600℃；霧化氣壓力為60 kPa；輔助氣壓力是60 kPa；入口電壓是10 V；碰撞室出口電壓為14 V。MTX、LEV和氨基蝶呤(內(nèi)標(biāo))的質(zhì)譜參數(shù)見Tab 1。

Tab 1 Patameters of mass spectrometry

2.3溶液的配制

2.3.1儲(chǔ)備液和工作液配制 分別精密稱取MTX、LEV適量，放到10 mL棕色的容量瓶中，用甲醇溶解定容，配制成MTX、LEV濃度分別是2.2 mmol·L-1和5.9 mmol·L-1的貯備液，于4℃冰箱儲(chǔ)存。用移液槍分別精密吸取MTX、LEV標(biāo)準(zhǔn)品貯備液適量，用50%甲醇水溶液逐級稀釋，配制成MTX濃度為11、4.4、2.2、1.1、0.22、0.11、0.022、0.011 μmol·L-1的工作液和LEV濃度為58.8、29.4、11.8、5.88、2.94、0.588、0.294、0.0588 μmol·L-1工作液，備用。精密稱取氨基蝶呤(內(nèi)標(biāo))適量置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解至刻度線均勻，配制成濃度為0.227 mmol·L-1的內(nèi)標(biāo)貯備液，置于4℃冰箱保存。精密吸取氨基蝶呤500 μL，置于50 mL的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為2.27 μmol·L-1的內(nèi)標(biāo)，4℃冷藏，備用。

2.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品配制 用移液槍量取5 μL上述配好的工作液，加入45 μL空白大鼠血漿配制MTX和LEV的血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線，使得終濃度分別為1.1、2.2、11、22、110、220、440、1 100 nmol·L-1；5.88、29.4、58.8、294、588、1 180、2 940、5 880 nmol·L-1。精密稱取MTX和LEV各10.0 mg，按照上述方法配制低、中、高3個(gè)質(zhì)控制(QC)樣品，MTX、LEV濃度分別為2.2、110、880 nmol·L-1；11.8、588、4 700 nmol·L-1。

2.4給藥方案、樣品采集與處理大鼠隨機(jī)分為3組：1 mg·kg-1MTX組、180 mg·kg-1LEV組、合用組，每組5只。在0、0.16、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、24、48 h眼底靜脈叢取血，離心取血漿用于檢測；將大鼠飼養(yǎng)于代謝籠，并按分組灌胃給藥，于8、24、48 h收集尿液用于檢測；按上述分組給藥后在1、2、4 h取大鼠肝、腎標(biāo)本進(jìn)行HE染色。取血漿、稀釋尿液樣品50 μL，加入10 μL內(nèi)標(biāo)和150 μL甲醇沉淀劑，渦旋2 min，離心(12 000×g，10 min)，取上清液100 μL用于UPLC/MS/MS的測定。血漿和尿液于-20℃冰箱保存待測。

2.5方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1專屬性 按照“2.3”項(xiàng)下要求，用大鼠的空白血漿，配成1.1 nmol·L-1的MTX和5.88 nmol·L-1LEV血漿樣品，與空白血漿經(jīng)處理后一起分析，觀察空白血漿中的成分是否對待測物和內(nèi)標(biāo)存在干擾。

2.5.2線性、最低定量限 按照“2.3”項(xiàng)下要求配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以待測物濃度(x)為橫坐標(biāo)，待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值(y)為縱坐標(biāo)，用加權(quán)(W=1/x2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸系數(shù)(r2>0.99)。最低定量(LLOQ)為標(biāo)曲的最低點(diǎn)。

2.5.3精密度、準(zhǔn)確度 按照“2.3”項(xiàng)下要求配的3個(gè)QC濃度的樣品，每一濃度6個(gè)樣本，1 d內(nèi)同批次處理，連續(xù)檢測3 d并進(jìn)行分析，根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品濃度，評價(jià)分析方法的準(zhǔn)確度與精密度結(jié)果RSD和RE應(yīng)在± 15%之內(nèi)。

2.5.4提取回收率、基質(zhì)效應(yīng) 按照“2.3”項(xiàng)下要求配制3個(gè)QC濃度的血漿樣品，每個(gè)濃度6個(gè)樣本，并按照“2.4”項(xiàng)進(jìn)行處理后進(jìn)行分析。樣本為A。分別取5只大鼠的空白血漿50 mL，加入150 mL甲醇，渦漩1 min后離心(12 000 ×g，10 min)，取上清液45 mL，加入5 mL工作液(相當(dāng)于甲氨蝶呤2.2、110、880 nmol·L-1；左乙拉西坦11.8、588、4 700 nmol·L-1)，按照“2.4”項(xiàng)處理后，LC-MS/MS測定。樣本為B。按照“2.3”項(xiàng)下要求，配的3個(gè)QC濃度的工作液，每個(gè)濃度6個(gè)工作液，并直接進(jìn)樣分析。樣本為C。計(jì)算公式：提取回收率=A/B；基質(zhì)效應(yīng)=B/C。

2.5.5穩(wěn)定性 穩(wěn)定性考察是指甲氨蝶呤和左乙拉西坦在血漿樣品室溫放置4 h、經(jīng)歷3次冷凍、解凍循環(huán)和4℃冷藏8 h的穩(wěn)定性。按照“2.3”項(xiàng)下要求，配制低、中、高濃度的QC血漿樣品，每個(gè)濃度在每個(gè)穩(wěn)定條件平行6個(gè)樣本進(jìn)行分析。儲(chǔ)存的樣品與新配制樣品相比較來證明樣品穩(wěn)定性。用空白大鼠血漿稀釋工作液，每一個(gè)濃度平行6個(gè)樣本，考察稀釋穩(wěn)定。樣本濃度均在配制濃度的±15%范圍，則樣品穩(wěn)定。

2.5.6生物樣品的適用性 按照“2.3”項(xiàng)下要求，分別制備3個(gè)濃度的QC，每濃度平行6份的稀釋尿液樣品進(jìn)行分析。樣品濃度的RSD在±15%以內(nèi)，則該分析方法適用于稀釋尿液樣品。

3 結(jié)果

3.1方法學(xué)

3.1.1專屬性 血漿樣品中，甲氨蝶呤、左乙拉西坦、氨基蝶呤保留時(shí)間分別為3.02 min、3.09 min和2.95 min，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測定，方法專屬性高(Fig 1)。

3.1.2線性和最低定量限 左乙拉西坦：y=0.061 2x+0.2429 (r2=0.991 9)；線性范圍為5.88～5 880 nmol·L-1，最低定量限為5.88 nmol·L-1；甲氨蝶呤：y=0.026 6x+0.462 5 (r2=0.9936)；線性范圍為1.1～1 100 nmol·L-1，最低定量限1.1 nmol·L-1。

3.1.3精密度和準(zhǔn)確度 甲氨蝶呤和左乙拉西坦的質(zhì)控樣品在日內(nèi)精密度、日間精密度、準(zhǔn)確度都符合生物樣本要求(Tab 2)，表明該分析方法的重現(xiàn)性比較好，可用于檢測左乙拉西坦和甲氨蝶呤的濃度。

3.1.4提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 甲氨蝶呤和左乙拉西坦在3個(gè)濃度水平上的提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)都符合藥典規(guī)定(Tab 3)。

Fig 1 Representive MRM chromatograms of IS, MTX and LEV

A, D, G:Representative chromatograms blank plasma; B, E, H: Representative chromatograms of blank homogenate spiked with IS, LEV and MTX; C, F, I: Representative chromatograms of plasma sample from pharmacokinetic study after coadministration of LEV and MTX. IS: Aminopurine; MTX: Methotrexatein; LEV: Levetiracetam.

Tab 2 Accuracy and precision of methotrexate and levetiracetam in rat plasma

Tab 3 Matrix effect and extraction recovery of methotrexate and levetiracetam in rat plasma

Tab 4 Stability of levetiracetam and methotrexatein in rat plasma

aPlace 4h at room temperature(25℃)；b4℃ storage for 8 h；c-20℃ refrigeration cycle three times

Tab 5 Dilution effect of methotrexate and levetiracetam in plasma samples

3.1.5穩(wěn)定性 甲氨蝶呤和左乙拉西坦血漿樣品室溫放置4 h、經(jīng)歷3次冷凍、解凍循環(huán)和4℃冷藏8 h后，穩(wěn)定性良好，見Tab 4；血漿樣品稀釋后，甲氨蝶呤和左乙拉西坦的精確度和準(zhǔn)確度都滿足要求(Tab 5)，表明樣品可被稀釋。

3.1.6生物樣品的適用性 為了分析該方法在稀釋尿液樣品中的適用性，我們分析了3個(gè)濃度的稀釋尿液樣品，其RSD和RE值滿足要求(Tab 6)。

3.2MTX與LEV在大鼠體內(nèi)相互作用研究

3.2.1藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)研究 為了探究MTX和LEV在大鼠體內(nèi)的相互作用，我們進(jìn)行了大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)。MTX和LEV在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見Tab 7，藥時(shí)曲線見Fig 2。兩藥合用后，MTX的Cmax、AUC0-t、Tmax值升高，T1/2、Cl、MRT值下降，各參數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；LEV的Tmax、T1/2、Cl有一定的上升趨勢，AUC0-t有一定的下降趨勢，各參數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明LEV明顯增加MTX在大鼠體內(nèi)的吸收。

Fig 2 Mean plasma concentration-time curves of MTX and LEV in rats

A: Mean plasma concentration-time curves of MTX after oral administration MTX and MEX plus LEV; B: Mean plasma concentration-time curves of LEV after oral administration MTX and MEX plus LEV.

Tab 6 Application of analytical methods in the Urine samples

Tab 7 Pharmacokinetic parameters of methotrexatein and levetiracetam

*P<0.05vsMTX group

3.2.2腎臟排泄研究 為了探究MTX血藥濃度升高對腎臟排泄的影響，我們通過代謝籠驗(yàn)證了MTX和LEV單用及合用后大鼠的腎臟排泄水平。在8、24、48及48 h總量4個(gè)水平上，與口服單用MTX和LEV組相比，MTX腎臟排泄量在合用組明顯增多，而LEV的腎臟排泄量在合用組減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 3)。結(jié)果表明，LEV明顯增加MTX在大鼠體內(nèi)的吸收，使其血藥濃度升高、腎排泄增加。

3.2.3肝腎毒性研究 為了探究MTX血藥濃度及尿排泄的增加對肝腎急性毒性的影響，選取給藥后1、2、4 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，取老鼠肝、腎組織，經(jīng)福爾馬林溶液固定24 h后，經(jīng)石蠟切片進(jìn)行HE染色后。肝臟病理切片結(jié)果顯示，與對照組相比，MTX組、LEV組肝臟均無明顯的病理變化，MTX和LEV合用組肝損傷也不明顯，僅在4 h組在肝門靜脈附近肝細(xì)胞有少量的空泡樣變性(紅色箭頭所示部位，F(xiàn)ig 4)。腎臟病理切片結(jié)果顯示，與對照組相比，LEV組大鼠腎臟無病理學(xué)改變，MTX組大鼠腎臟在腎小球附近部分腎小管可見輕微損傷，表現(xiàn)為顆?？张輼幼冃?、管腔輕度擴(kuò)張(紅色箭頭所示部位)，MTX和LEV合用組腎小管損傷明顯增加，表現(xiàn)為腎小管大量的顆?？张輼幼冃?、部分刷毛緣脫落、部分管腔可見細(xì)胞碎片(紅色箭頭、紅色方框所示部位，F(xiàn)ig 5)。結(jié)果表明，合用MTX和LEV后大鼠肝腎毒性都明顯增加，且腎臟毒性的增加遠(yuǎn)高于肝毒性。

Fig 3 Renal excretion of MEX and LEV in rats

A: Renal excretion of MEX after oral administration MTX and MEX plus LEV at 8 h, 12 h, 24 h.*P<0.05vsMTX group; B: Renal excretion of LEV after oral administration MTX and MEX plus LEV at 8 h, 12 h, 24 h.*P<0.05,**P<0.01vsLEV group.

Fig 4 Rats liver pathological slices(HE×200)

Rat liver was taken after oral administration LEV, MTX and MTX plus LEV at 1 h, 2 h and 4 h. The red arrow marks the place where the damage occurred. Compared to LEV and MTX group, MTX plus LEV group increased liver damage significantly.

4 討論

由于MTX具有抗炎和免疫抑制雙重作用[8]，因此在臨床應(yīng)用比較廣泛，但其毒副作用也比較明顯。2017年3月23日，國家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測中心發(fā)布的藥物警戒快訊中提到，加拿大衛(wèi)生部提示LEV和MTX合用可能會(huì)導(dǎo)致血液中MTX濃度升高，引起可能是致死性(包括突發(fā)急性腎衰竭)的嚴(yán)重副作用[8]。我們的實(shí)驗(yàn)證明，LEV明顯增加MTX在大鼠體內(nèi)的吸收，使其血藥濃度升高，腎排泄增加，造成明顯的肝腎損傷，且對腎臟毒性的影響要明顯大于肝臟毒性。有文獻(xiàn)報(bào)道[9]，LEV可以延長MTX的排泄。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，口服合用LEV與MTX后，MTX的排泄明顯增加，而LEV的排泄明顯減少。MTX的排泄明顯增加可能是因?yàn)镸TX血藥濃度增加的原因，但也不排除LEV與MTX在腎臟發(fā)生相互作用的可能?？紤]到合用LEV與MTX后，LEV在血藥濃度變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的情況下腎臟排泄明顯減少，MTX與LEV以腎臟為靶點(diǎn)發(fā)生相互作用的可能性是很大的，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證兩藥在腎臟相互作用的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，臨床上聯(lián)合使用LEV與MTX時(shí)需要進(jìn)行劑量調(diào)整。

Fig 5 Rats kidney pathological slices(HE×400)

Rat kidney was taken after oral administration LEV, MTX and MTX plus LEV at 1 h, 2 h and 4 h. The red arrow marks the place where the damage occurred. Compared to LEV and MTX group, MTX plus LEV group increased kidney damage significantly.

(致謝：感謝河北省臨床醫(yī)學(xué)研究中心/河北省代謝病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供大鼠實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室；感謝河北省人民醫(yī)院病理科康林老師對病理切片結(jié)果的指導(dǎo)。)

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