馬 翠，陳雅琳，白天鴿，魏 虹

(石河子大學醫(yī)學院組織胚胎學教研室，新疆 石河子 832002)

白血病是一類起源于造血干細胞的克隆性惡性血液疾病，其中急性白血病比慢性白血病多見(約5.5 ∶1)，我國白血病發(fā)病率為2.76/10萬，呈逐年上升趨勢。阿糖胞苷(cytosine arabinoside，Ara-C)屬于細胞S增殖期的嘧啶類抗代謝藥物，通過抑制細胞DNA的合成，干擾細胞的增殖，是目前國際公認的抗急性髓系白血病的標準治療之一。由于其骨髓抑制、血液不良反應、肝臟損害等毒副作用及耐藥性的出現(xiàn)，使得高劑量化療藥物的使用受限，而且單一化療也已經(jīng)不能滿足臨床需要。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展千變萬化，是多因素、多基因參與的復雜過程，綜合多方面治療是目前腫瘤治療的主要研究方向。

姜黃素(curcumin，CUR)因其具有選擇性殺傷腫瘤細胞、對正常細胞毒副作用小的優(yōu)點，近年來越來越受到腫瘤治療領域的重視。盡管已有研究表明，CUR及其衍生物能誘導白血病細胞發(fā)生凋亡[1-2]、自噬[3]、抑制白血病細胞的浸潤、轉移[4]及逆轉多藥耐藥[5]，且CUR既能逆轉非小細胞肺癌分子靶向藥物耐藥作用[6]，也可聯(lián)合5-氟尿嘧啶優(yōu)化結直腸癌細胞的治療[7]，以及協(xié)同白消安誘導提高KG1a細胞凋亡作用[8]。但目前并無CUR聯(lián)合Ara-C用于急性髓系白血病KG1a細胞的研究。本實驗通過CUR誘導KG1a細胞自噬、凋亡，并與小劑量化療藥物Ara-C聯(lián)合，觀察對KG1a細胞增殖、自噬、凋亡的影響，進一步探討自噬與凋亡之間的聯(lián)系，以期減少Ara-C在臨床應用中的不良影響，為臨床白血病的聯(lián)合治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清、碘化丙啶、吖啶橙、CUR、Ara-C均購自美國Sigma公司；3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)購自美國APE×BIO公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(Solarbio公司)；細胞周期試劑盒(Beyotime公司)；PrimeScriptTMRT reagent Kit逆轉錄試劑盒(TaKaRa公司)；β-actin鼠單抗、caspase-3兔單抗、LC3A/B兔單抗、Bcl-2兔單抗、Beclin1兔單抗，均購自美國Cell Signaling Technology公司。CUR和3-MA用DMSO配制成儲存液，Ara-C用PBS配制成儲存液于-20℃冰箱保存，應用時RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋到相應終濃度。

1.1.2細胞株 人急性髓系白血病細胞株KG1a購自廣州賽庫生物技術有限公司。KG1a細胞用含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d更換1次培養(yǎng)液。

1.1.3儀器 全光柵酶標儀(美國Thermo Fisher)；實時定量PCR儀(杭州安杰思公司)；超微量核酸蛋白測定儀(北京凱奧公司)；流式細胞儀(Mindray公司)。

1.2方法

1.2.1MTT法檢測急性髓系白血病KG1a細胞增殖 將5×105個處于對數(shù)生長期的KG1a細胞接種于96孔板，每孔180 μL。按照實驗分組(CUR:20、40、60、80 μmol·L-1; Ara-C:0.02、0.1、0.5、2.5 μmol·L-1)進行操作，每組設3個復孔，20 μL的5 g·L-1MTT溶液避光在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h后，終止培養(yǎng)，棄上清。每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min，使結晶物充分溶解，490 nm檢測各孔的OD值。計算各組細胞增殖抑制率(inhibition rate，IR)：IR=[(OD值陰性對照組-OD值空白對照組)-(OD值實驗組-OD值空白對照組)]/(OD值陰性對照組-OD值空白對照組)×100%。

1.2.2吖啶橙法觀察自噬泡的形成 1×106個細胞接種至24孔板，藥物處理后，置37℃、5% CO2及飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)，孵育后，在24、48 h分別取出細胞，PBS洗滌，加1 μL的吖啶橙染液，避光染色20 min后，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3流式細胞儀檢測細胞凋亡率和細胞周期 取對數(shù)生長期的細胞，以1×106個細胞接種于24孔板中，藥物處理48 h后收集細胞，PBS洗滌1遍后，每組各加100 μL結合液、2 μL FITC、2 μL PI，避光反應20 min后，上流式細胞儀檢測。同理在24 h后收集上述各實驗組的細胞，按照周期檢測試劑盒說明書進行操作，檢測細胞周期。

1.2.4實時熒光定量PCR提取各組細胞總RNA，使用逆轉錄試劑盒操作說明書獲得cDNA，PCR反應體系：10.0 μL SYBR Select Master Mix (2×)，2.0 μL cDNA模板，上、下游引物各0.8 μL，加水至總體積為20.0 μL。95℃ 1 min；95℃ 10 s，60℃ 34 s，35循環(huán)；60℃ 1 min。引物序列見Tab 1。以2-△△Ct法計算基因相對表達量。

Tab 1 Sequences of primers

1.2.5Western blot檢測凋亡及自噬蛋白表達 取對數(shù)生長期的KG1a細胞，細胞分組，在37℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)48 h后，RIPA裂解液提取總蛋白，每個泳道上蛋白樣品30 μg，經(jīng)10% SDS-PAGE電泳后，利用濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上，用含5% BSA的PBST溫箱中封閉1 h，洗滌1次后，分別加入對應一抗(β-actin、caspase-3、LC3A/B、Bcl-2、Beclin-1，均1 ∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜，PBST洗滌3次，每次10 min；加入山羊抗兔IgG抗體孵育1 h。曝光拍照分析。

2 結果

2.1CUR和Ara-C對細胞生長的影響如Fig 1所示，CUR在48 h的IC50為42.01 μmol·L-1，在不同的處理時間上，隨著CUR濃度的增加，其對KG1a細胞的抑制作用明顯增強(P<0.01)，即抑制率與劑量呈明顯正相關(R=0.723)。隨著CUR處理細胞時間的延長(24～72 h)，其對細胞的抑制作用明顯增加(P<0.05)，即抑制率與時間呈正相關(R=0.573)。表明CUR對KG1a細胞有一定的時間、劑量依賴性。同時Ara-C也對KG1a細胞有一定的時間、劑量依賴性。在此選擇CUR 40 μmol·L-1與Ara-C 0.5 μmol·L-1聯(lián)用，在處理細胞48 h后，如Fig 2所示，聯(lián)用組細胞抑制率高于各單藥組，經(jīng)3-MA預處理的各組細胞抑制率明顯增加且高于各自單用組，差異有顯著性(P<0.01)。各組均與對照組有明顯差異(P<0.01)。

Fig 1 Anti-proliferation effect of CUR(A) and Ara-C(B) on KG1a cells by MTT

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsadjacent low concentrations at the same time;△P<0.05,△△P<0.01vstime (24 hvs48 h, 48 hvs72 h)

Fig 2 Effect of different drug groups on the growth of KG1a cells after 48

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vs3-MA 10 mmol·L-1pretreatment group;△P<0.05,△△P<0.01vs40 μmol·L-1CUR+0.5 μmol·L-1Ara-C group

2.23-MA抑制姜黃素誘導的KG1a細胞自噬如Fig 3所示，陽性實驗組(饑餓組)細胞質中出現(xiàn)大量酸性囊泡，在藥物作用24、48 h后，與對照組相比，細胞質中的酸性囊泡不斷增加，且含自噬囊泡的細胞也在增加，同時細胞形態(tài)也發(fā)生了改變。CUR 40 μmol·L-1與Ara-C 0.5 μmol·L-1聯(lián)合處理細胞后的含酸性囊泡細胞個數(shù)及單個細胞中酸性囊泡數(shù)均明顯增多，但在3-MA預處理下，每組細胞內的自噬囊泡相對減少。

2.33-MA增強CUR、Ara-C或合用組對KG1a細胞的凋亡誘導作用藥物處理48 h后，聯(lián)合處理組較CUR和Ara-C組凋亡率明顯升高，均高于對照組(P<0.05，除了CUR組與對照組沒有顯著性差異)。3-MA預處理后的聯(lián)合處理組、CUR或Ara-C組的細胞凋亡明顯上升，均分別高于其單用組，差異有顯著性(P<0.01)。自噬抑制劑3-MA單獨處理細胞凋亡率達到(16.48±0.06)%，明顯高于對照組(Fig 4、5)。

2.4細胞周期分布情況如Fig 6所示，CUR和Ara-C分別作用細胞24 h后，細胞主要被阻滯在G0/G1期。0.5 μmol·L-1Ara-C組細胞與空白組比較，G0/G1期細胞明顯增多(P<0.01)，G2期細胞則明顯減少(P<0.01)；40 μmol·L-1CUR組與空白組比較，G0/G1期增多、S期和G2期則明顯減少(P<0.05)。

Fig 3 Acridine orange detecting the autophagy after the drug treatment of 24, 48 h(×400)

Fig 4 Comparison of apoptosis rate of KG1a cells in different treatment groups

A:Control; B:CUR 40 μmol·L-1+Ara-C 0.5 μmol·L-1; C: CUR 40 μmol·L-1; D: Ara-C 0.5 μmol·L-1; E: 3-MA 10 mmol·L-1; F: 3-MA 10 mmol·L-1+CUR 40 μmol·L-1; G: 3-MA 10 mmol·L-1+Ara-C 0.5 μmol·L-1; H: 3-MA 10 mmol·L-1+CUR 40 μmol·L-1+Ara-C 0.5 μmol·L-1.

2.5凋亡及自噬蛋白的表達如Fig 7所示，KG1a細胞經(jīng)處理48 h后，聯(lián)合組的caspase-3和裂解片段的相對表達量均高于單獨作用組，且與對照組相比差異有顯著性(P<0.01)；經(jīng)3-MA預處理的40 μmol·L-1CUR組caspase-3表達低于CUR單用組(P<0.01)。抗凋亡蛋白Bcl-2因表達量過低未檢測出。聯(lián)合組自噬標志蛋白Beclin-1表達高于單藥組，且較對照組明顯升高，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉化上升，0.5 μmol·L-1Ara-C與40 μmol·L-1CUR的聯(lián)合處理組出現(xiàn)明顯的自噬反應。在3-MA預處理后，40 μmol·L-1CUR組Beclin-1和LC3蛋白的表達明顯降低(P<0.01)。

2.6CUR與Ara-C聯(lián)合對caspase-3、Bcl-2、LC3、Beclin-1基因表達的影響如Fig 8所示，藥物處理48 h后，各實驗組細胞Bcl-2基因的表達水平明顯低于對照組(P<0.01)，CUR+Ara-C組Bcl-2 mRNA低于單獨組(P<0.01)，在3-MA預處理下，CUR組Bcl-2 mRNA較單獨CUR組降低(P<0.05)。caspase-3與Bcl-2基因表達變化正好相反，聯(lián)用組高于單用組，3-MA預處理組高于CUR單獨組(P<0.05)。Beclin-1和LC3的基因表達水平均與對照組有明顯差異(P<0.05)，CUR+Ara-C組Beclin-1 mRNA表達量明顯高于單用組，經(jīng)3-MA預處理后的CUR組明顯降低(P<0.05)。而LC3的基因表達變化沒有顯著性差異。

Fig 5 Effect of drugs on KG1a cell 8)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vs3-MA 10 mmol·L-1pretreatment group;△P<0.05,△△P<0.01 vs 40 μmol·L-1CUR+0.5 μmol·L-1Ara-C group

Fig 6 Effects of CUR and Ara-C on cell cycle distribution of the acute myeloid leukemia KG1a

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsAra-C G0/G1phase;△△P<0.01vsCUR G0/G1phase

Fig 7 KG1a cells were treated with CUR and Ara-C for 48 h, and the expression of Beclin-1, caspase-3 and LC3 proteins were analyzed by Western

1:Control 0 μmol·L-1; 2: Ara-C 0.5 μmol·L-1; 3: CUR 40 μmol·L-1+3-MA 10 mmol·L-1; 4: CUR 40 μmol·L-1; 5: Ara-C 0.5 μmol·L-1+ CUR 40 μmol·L-1.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsAra-C+CUR group;△P<0.05,△△P<0.01 vs CUR 40 μmol·L-1.

Fig 8 The mRNA expression of caspase-3, Bcl-2, Beclin-1 and LC3 in KG1a cells treated with CUR and Ara-C for 48

1:Control; 2:Ara-C 0.5 μmol·L-1; 3: CUR 40 μmol·L-1+3-MA 10 mmol·L-1; 4:CUR 40 μmol·L-1; 5:Ara-C 0.5 μmol·L-1+CUR 40 μmol·L-1.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsAra-C+CUR group;△P<0.05,△△P<0.01vsCUR 40 μmol·L-1.

3 討論

急性髓系白血病是常見惡性腫瘤之一，治療主要依靠骨髓移植，但化療是其常見的輔助治療手段，由于Ara-c等化療藥物的不良反應及其耐藥性，導致治療效果不理想，影響患者預后。因此，如何能在減少化療藥物的劑量和機體傷害的情況下，提高化療藥物的療效是許多研究的目標。國內外研究發(fā)現(xiàn)，CUR既能逆轉非小細胞肺癌分子靶向藥物耐藥作用[6]，也可誘導結直腸癌細胞[7]、KG1a細胞[8]、白血病K562細胞[3]等凋亡與自噬。

腫瘤的發(fā)生過程受多種因素影響，不同藥物對不同腫瘤的抗腫瘤活性不同。當細胞發(fā)生自噬時，一方面自噬使細胞免受惡劣環(huán)境的傷害，另一方面是一種有別于凋亡的Ⅱ型程序性死亡或自噬性死亡[9]。細胞自噬是一個極其復雜的過程，在生長因子、DNA損傷等條件下，均可誘導細胞自噬的發(fā)生。Beclin-1、LC3是參與自噬過程的兩個主要蛋白，CUR聯(lián)合Ara-C處理發(fā)現(xiàn)Beclin-1和LC3均比單一處理組表達量明顯升高，說明CUR能上調Ara-c對細胞的自噬活性。自噬抑制劑3-MA能夠抑制CUR誘導的KG1a細胞自噬。細胞凋亡是生物體發(fā)生、發(fā)展過程中的自然現(xiàn)象，它是由相關基因主導的程序性死亡方式。本實驗中CUR聯(lián)合Ara-C處理組的caspase-3和激活片段的表達量高于CUR單獨處理組，而抗凋亡基因Bcl-2則相反。流式細胞儀檢測呈現(xiàn)相似的結果，3-MA抑制自噬促進細胞凋亡。這與有關報道一致，如在白血病細胞株中，抑制自噬能達到更好的藥物效果[10-12]，細胞自噬也能引起白血病細胞的抗藥性[13]。

Beclin-1蛋白的BH3結構域能與Bcl-2蛋白結合，抑制其促進自噬的活性[14]，Bcl-2的減少同時也減少了與Beclin-1的結合，削弱抑制自噬的作用，因此增加了細胞自噬的活性和凋亡的發(fā)生。Beclin-1不僅參與自噬的起始，而且能與Bcl-2通過相互作用，介導凋亡的發(fā)生。CUR聯(lián)合Ara-c處理組中的Bcl-2明顯低于單一組，代表自噬激活的Beclin-1和LC3基因表達上升，然而Bcl-2基因的下調代表凋亡率的增加，在3-MA存在的情況下，Beclin-1和Bcl-2的下調代表自噬活性的降低，并誘發(fā)凋亡的產(chǎn)生。自噬和凋亡的關系復雜多變，已有過他們關系的研究[15]。但對KG1a細胞的研究發(fā)現(xiàn)，3-MA預處理后的細胞凋亡率明顯增高，但3-MA預處理組的蛋白實驗又顯示其凋亡相關蛋白caspase-3的表達量并不高于CUR單用組，這可能是3-MA造成的半胱天冬酶依賴性死亡，其功能與它對自噬的抑制無關。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，CUR能夠增加KG1a細胞對Ara-C的敏感性和凋亡，也會誘導自噬的產(chǎn)生。但是此自噬作用起到部分保護細胞免受化療藥物損傷的作用，我們可以將自噬抑制劑與凋亡誘導劑聯(lián)用，抑制腫瘤細胞的生長，為以后臨床用藥提供理論基礎。

總之，CUR能明顯提高KG1a細胞對Ara-C的敏感性，促進細胞凋亡，并誘導細胞產(chǎn)生自噬，通過自噬產(chǎn)生耐藥，3-MA抑制自噬能夠增強藥物抗腫瘤的療效與促凋亡作用。聯(lián)合使用自噬抑制劑與凋亡誘導劑可能是治療白血病用藥的新方向。

(致謝：對石河子大學組織胚胎教研室、新疆地方與民族高發(fā)病重點實驗室的全體老師和工作人員的全力支持表示衷心的感謝。)

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