亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        化合物W3D通過調(diào)控TLR4-MyD88-NF-κB通路抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥因子的釋放

        2018-07-04 11:16:02羅捷然李青山
        中國藥理學(xué)通報(bào) 2018年7期
        關(guān)鍵詞:抗炎炎性化合物

        羅捷然,趙 蓓,唐 莉,葛 睿,李青山,2

        (1. 山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,山西 太原030001 ;2. 山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,山西 太原 030024)

        炎癥是機(jī)體受到外界刺激時(shí)所產(chǎn)生的損傷和抗損傷的雙重反應(yīng),過度或持續(xù)的炎癥反應(yīng)可引起組織損傷和機(jī)能障礙[1-2],如癌癥、動脈粥樣硬化、神經(jīng)退行性疾病、慢性炎性腸病、銀屑病等[3-4]。目前,臨床使用的抗炎藥物主要有非甾體類抗炎藥和甾體類抗炎藥兩大類,但服用后的不良反應(yīng)不容忽視[5-6]。因此,發(fā)現(xiàn)活性更高、副作用更小的新型抗炎藥物仍是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

        苯并噁唑酮是一種具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗HIV和骨骼肌松弛等多種生物活性的天然物質(zhì)[7-8]。課題組以苯并噁唑酮為母環(huán)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)優(yōu)化,并獲得了一系列新型苯并噁唑酮衍生物[9-10],然而,該類化合物的抗炎作用靶點(diǎn)未知,作用機(jī)制尚不明確,嚴(yán)重制約了其進(jìn)一步的合理設(shè)計(jì)與藥理活性的深入研究。4-(5′-二甲氨基)-萘磺酰氧基苯并噁唑酮(W3D)為課題組設(shè)計(jì)合成的新型苯并噁唑酮衍生物,其命名及結(jié)構(gòu)見Tab 1,前期活性篩選呈現(xiàn)出較好的體內(nèi)抗炎活性,且較相同劑量陽性藥塞來昔布無明顯差別,然而其抗炎作用機(jī)制尚不明確。因此,本研究擬以化合物W3D為小分子探針,采用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)的小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7作為體外炎癥模型,通過測定炎癥因子的表達(dá)評價(jià)其體外抗炎活性,并運(yùn)用Western blot和RT-PCR技術(shù),從信號通路的調(diào)控方面闡述其抗炎作用機(jī)制,為該類化合物的進(jìn)一步合理設(shè)計(jì)提供依據(jù)。

        Tab 1 Name and structure of the compound W3D

        1 材料

        1.1細(xì)胞株小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株購自武漢博士德生物工程有限公司。

        1.2藥品與試劑化合物W3D由課題組合成,其結(jié)構(gòu)經(jīng)過確證,純度≥98%,用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的W3D均用DMSO溶液配制;DMEM高糖培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、小鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白介素1β(interleukin 1β,IL-1β)、白介素6(interleukin 6,IL-6) ELISA檢測試劑盒、胞核胞質(zhì)蛋白提取試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(武漢博士德生物工程有限公司);環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase 2,COX-2) ELISA檢測試劑盒(上海西塘生物可以有限公司);LPS(美國Sigma公司);Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)、磷酸化白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶4(phosphorylated interleukin-1 receptor-associated kinase 4,p-IRAK4)、髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)、核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)一抗(CST公司);RNAiso plus mRNA抽提試劑、熒光實(shí)時(shí)定量PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)。

        1.3儀器全波長多功能酶標(biāo)儀、FQ-PCR儀(賽默飛世爾科技有限公司),光學(xué)倒置顯微鏡(重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司),二氧化碳培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限責(zé)任公司)。

        2 方法

        2.1細(xì)胞培養(yǎng)將RAW264.7細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中,于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)孵箱中培養(yǎng),取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

        2.2MTT法檢測化合物W3D對細(xì)胞活力的影響待細(xì)胞生長至90%,分別加入培養(yǎng)液、溶劑(DMSO)、W3D(6.25、12.5、25、50、100 μmol·L-1),繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄去細(xì)胞上清液,每孔加入0.1 mL MTT(5 g·L-1),于37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄去上清后,每孔加入0.1 mL DMSO,振蕩, 490 nm處檢測吸光度,并計(jì)算細(xì)胞存活率。

        2.3ELISA法檢測細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β、COX-2的含量將對數(shù)期細(xì)胞接種于24孔板,待細(xì)胞密度長至70%~80%,隨機(jī)分為空白對照組、模型組(1 mg·L-1LPS)、陽性藥物組(25 μmol·L-1塞來昔布與LPS共同作用)、化合物組(6.25、12.5、25、50、100 μmol·L-1W3D與LPS共同作用),培養(yǎng)24 h后,吸取上清,采用ELISA法,檢測TNF-α、IL-6、IL-1β、COX-2的含量,并計(jì)算其IC50值。

        2.4Westernbolt法檢測IL-6、TLR4、MYD88、p-IRAK4和NF-κB的蛋白表達(dá)分別收集空白對照組,模型組(1 mg·L-1LPS),化合物組(12.5、25、50 μmol·L-1W3D與LPS共同作用)細(xì)胞,PBS沖洗后,離心,收集細(xì)胞,用含有1% PMSF的RIPA高效細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞蛋白, BCA法進(jìn)行蛋白定量。于SDS-PAGE電泳進(jìn)行蛋白分離,半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉2~3 h,一抗孵育,4℃過夜,二抗孵育1 h,ECL超敏顯影液顯影,檢測IL-6、TLR4、MyD88、p-IRAK4的蛋白表達(dá)。依照上述方法,采用胞質(zhì)、胞核蛋白提取試劑,分別提取胞質(zhì)與胞核蛋白,并進(jìn)行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、二抗和顯影,檢測胞質(zhì)、胞核中NF-κB的蛋白表達(dá)。以β-actin為內(nèi)參,并用灰度值計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

        2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測TLR4、MyD88、IL-6mRNA的表達(dá)將對數(shù)期細(xì)胞接種至6孔板,24 h后隨機(jī)分為空白對照組、模型組(1 mg·L-1LPS)、化合物組(12.5、25、50 μmol·L-1W3D與LPS共同作用),繼續(xù)培養(yǎng)24 h,棄去培養(yǎng)液,RNAiso plus mRNA抽提試劑抽提細(xì)胞總RNA,按照試劑盒說明步驟去除DNA雜質(zhì),進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,以GAPDH為參照基因,檢測細(xì)胞中TLR4、MyD88、IL-6基因的相對表達(dá)。所有引物均由上海生工生物工程公司合成,引物序列見Tab 2。

        Tab 2 Primer sequence of quantitative real-time PCR

        3 結(jié)果

        3.1化合物W3D對RAW264.7細(xì)胞活力的影響如Fig 1所示,化合物W3D在0~100 μmol·L-1濃度下對RAW264.7細(xì)胞無明顯毒性,其細(xì)胞活力與空白對照組相比差異無顯著性。

        Fig 1 Effects of W3D on viability of RAW264.7

        3.2W3D對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6、IL-1β、COX-2的影響如Fig 2所示,

        Fig 2 Effects of W3D on the release amount of IL-6(A), TNF-α (B), IL-1β(C) and COX-2(D) in RAW264. 7 cells stimulated by LPS ##P<0.01 vs control group; *P<0.05, **P<0.01 vs LPS group

        化合物W3D對細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β有明顯的抑制作用,且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性,其中對IL-1β的抑制作用(IC50為20.07 μmol·L-1)與陽性藥塞來昔布(IC50為17.94 μmol·L-1)比較差異無顯著性,對IL-6的抑制作用(IC50為8.686 μmol·L-1)明顯高于塞來昔布(IC50為36.31 μmol·L-1),呈現(xiàn)出較好的抗炎活性。但其對LPS所誘導(dǎo)的COX-2上調(diào)并無明顯抑制作用。

        3.3W3D對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中IL-6、TLR4、MyD88、p-IRAK4和NF-κB蛋白表達(dá)的影響如Fig 3所示,與空白對照組相比,LPS可明顯上調(diào)RAW264.7細(xì)胞中炎癥效應(yīng)蛋白IL-6和TLR4-NF-κB信號通路蛋白TLR4、p-IRAK4、MyD88的表達(dá)。化合物W3D的干預(yù)則可抑制IL-6、TLR4、MyD88的表達(dá),抑制IRAK4的磷酸化,同時(shí)可抑制NF-κB的入核活化,且呈現(xiàn)良好的劑量關(guān)系。

        3.4W3D對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中TLR4、MyD88、IL-6mRNA表達(dá)的影響如Fig 4所示,LPS可明顯上調(diào)RAW264.7細(xì)胞TLR4、MyD88、IL-6 mRNA的表達(dá),而化合物W3D則對TLR4、MyD88、IL-6 mRNA的表達(dá)有明顯的抑制作用,且呈現(xiàn)良好的劑量依賴性。

        4 討論

        炎癥因子在炎癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用,其中最為關(guān)鍵的炎癥因子有TNF-α、IL-1β和IL-6。TNF-α是炎癥反應(yīng)過程中出現(xiàn)最早的炎性介質(zhì),可影響其他炎性因子的合成與釋放,對機(jī)體組織代謝也具有重要的調(diào)節(jié)作用[11]。IL-1β與IL-6則參與機(jī)體的免疫應(yīng)答,是炎性反應(yīng)的促發(fā)劑。因此,抑制炎癥因子的表達(dá)則可實(shí)現(xiàn)抗炎作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,W3D可明顯抑制小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá),尤其對IL-6的抑制活性明顯優(yōu)于陽性藥塞來昔布,但該化合物對COX-2卻沒有抑制作用,因此,探究其抗炎作用機(jī)制并發(fā)現(xiàn)作用靶點(diǎn)將為該類藥物的進(jìn)一步研究提供重要依據(jù)。

        A: The protein levels of IL-6 in LPS-induced RAW264.7 cells treated with W3D; B: The protein levels of TLR4, p-IRAK4 and MyD88 in LPS-induced RAW264.7 cells treated with W3D; C: The protein levels of total cellular NF-κB, nucleus and cytoplasm NF-κB in LPS-induced RAW264.7 cells treated with W3D in LPS-induced RAW264.7 cells treated with W3D.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsLPS group.

        Fig 4 Effects of W3D on the mRNA expression of TLR4, MyD88 and IL-6 on RAW264. 7 cells

        ##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsLPS group

        核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在炎癥中發(fā)揮重要作用,IL-6、IL-1β、TNF-α等在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)都可以由激活的NF-κB調(diào)控[12-13],而TLR4則是激活NF-κB最主要的跨膜信號轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,化合物W3D可明顯降低TLR4 的蛋白與mRNA表達(dá)水平,同時(shí)可抑制NF-κB的入核活化,因此,該化合物主要通過對TLR4-NF-κB信號通路的調(diào)控而發(fā)揮抗炎作用。

        TLR4 可通過髓化分子(MyD88)途徑與非髓化分子途徑來實(shí)現(xiàn)對NF-κB調(diào)控作用,其中TLR4-MyD88-IRAK4-NF-κB信號通路是最為重要的炎癥信號通路。TLR4可識別外界(LPS)炎性刺激,將胞外炎性信號轉(zhuǎn)移至胞內(nèi)重要銜接蛋白MyD88,接受到信號的MyD88可募集IRAK4,致使IRAK4磷酸化激活,通過下游一系列信號傳遞,最終使核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB發(fā)生磷酸化修飾活化入核,進(jìn)而啟動炎性因子的轉(zhuǎn)錄,使得炎性因子大量產(chǎn)生與釋放,從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生與發(fā)展[14-15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,化合物W3D可以明顯降低MyD88的蛋白與mRNA的表達(dá),抑制IRAK4的磷酸化激活和NF-κB蛋白的入核活化,進(jìn)而減少炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的釋放,發(fā)揮抗炎活性。因此,化合物W3D可能是通過對TLR4-MyD88-IRAK4-NF-κB信號通路的調(diào)控而發(fā)揮抗炎活性。

        綜上所述,化合物W3D可以通過調(diào)控LPS所激活的TLR4-MyD88-IRAK4-NF-κB炎癥信號通路,抑制炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表達(dá),從而發(fā)揮抗炎活性,且其對IL-6的抑制作用明顯強(qiáng)于塞來昔布,呈現(xiàn)出較好的開發(fā)前景,但其抗炎作用機(jī)制還需進(jìn)行更深入的研究。

        (致謝:本文所有實(shí)驗(yàn)均在山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,在此對實(shí)驗(yàn)參加人員表示衷心的感謝!)

        [1] 杜臻雁, 唐福林. 糖皮質(zhì)激素抗炎作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2006,86(35): 2512-5.

        [1] Du Z Y, Tang F L. The progress and advances in studies on the anti-inflammatory mechanisms of glucocorticoid [J].NatlMedJChina, 2006,86(35): 2512-5.

        [2] Qin J J, Wang W, Zhang R W. Novel natural product therapeutics targeting both inflammation and cancer [J].ChinJNatMed, 2017,15(6): 401-16.

        [3] 于水蓮, 陶 怡, 王羿升, 等. 炎癥因素與早期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎心血管病變相關(guān)性研究[J]. 中華風(fēng)濕病學(xué)雜志, 2016,20(11): 739-45.

        [3] Yu S L, Tao Y, Wang Y S, et al. The correlation between inflammatory burden with cardiovascular diseases in patients with early rheumatoid arthritis [J].ChinJRheumatol, 2016,20(11): 739-45.

        [4] Kim Y, Ahn C, Je J. Anti-inflammatory action of high molecular weight Mytilus edulis hydrolysates fraction in LPS-induced RAW264.7 macrophage via NF-κB and MAPK pathways [J].FoodChem, 2016,202:9-14.

        [5] A Martelli, L Testai, M Anzini, et al. The novel a-inflammatory agent VA694, endowed with both NO-releasing and COX2-selective inhibiting properties, exhibits NO-mediated positive effects on blood pressure, coronary flow and endothelium in an experimental model of hypertension and endothelial dysfunction [J].PharmacolRes, 2013,78: 1-9.

        [6] Elsaman T, Aldeeb O A A, Aboul-Fadl T, et al. Synthesis, characterization and pharmacological evaluation of certain enzymatically cleavable NSAIDs amide prodrugs [J].BioorgChem, 2017,70: 144-52.

        [7] Deng B L, Cullen M D, Zhou Z G, et al. Synthesis and anti-HIV activity of new alkenyldiaryl-methane(ADAM)non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors(NNRTIs) incorporating benzoxazolone and benzisoxazole rings [J].BioorgMedChem, 2006,14(7): 2366-74.

        [8] Tang L, Ma W, Ma Y, et al. Synthesis and biological activity of 4-substituted benzoxazolone derivatives as a new class of sEH inhibitors with high anti-inflammatory activity in vivo [J].BioorgMedChemLett, 2013,23(8): 2380-3.

        [9] 唐 莉, 班樹榮, 林文瀚, 等. 天然產(chǎn)物4-O-B-D-葡萄糖-苯并噁唑酮及4-取代苯并噁唑酮類衍生物的合成與其活性研究[J]. 中國藥物化學(xué)雜志, 2009,19(1): 31-5.

        [9] Tang L, Ban S R, Lin W H, et al. Synthesis and activities of natural product 4-O-β-D-glucopyranosyl-benzoxazolin-2(3H)-one and derivatives of 4-substituted benzoxazolone [J].ChinJMedChem, 2009,19(1): 31-5.

        [10] 羅捷然, 唐 莉, 葛 睿, 等, 新型苯并噁唑酮類衍生物4-鄰甲基苯磺酰氧基-苯并噁唑酮(MBB)抗炎作用的研究[A]. 中國藥學(xué)會第十三屆青年藥學(xué)科研成果交流會論文集[C]. 2016: 5.

        [10] Luo J R, Tang L, Ge R, et al. Study on anti-inflammatory effect of 4-(2-methylphenylsulfonyloxy)-2(3H)-benzoxazolone(MBB) [A]. Conference proceedings of the thirteenth session of National youth pharmaceutical scientific research achievement exchange of China pharmaceutical association[C]. 2016: 5.

        [11] 陳煥琦, 張子恒, 周 磊, 等. OSAHS 患者圍手術(shù)期應(yīng)用西吡氯銨含片的療效研究[J]. 臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志, 2017,31(14): 1123-6.

        [11] Chen H Q, Zhang Z H, Zhou L, et al. Effect of cetylpyridinium chloride Buccal tablets on perioperative application of OSAHS patients [J].JClinOtorhinolarynglolgyHeadNeckSurg, 2017,31(14): 1123-6.

        [12] Suzuki A, Hanada T, Mitsuyama K, et al. CIS3/SOCS3/SSI3 plays a negative regulatory role in STAT3 activation and intestinal inflammation [J].JExpMed, 2001,193(4): 471-81.

        [13] 李德川, 鮑秀琦, 張德武, 等. 去氫丹參新酮對神經(jīng)炎癥的抑制作用及機(jī)制研究[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào), 2016,32(2): 177-83.

        [13] Li D C, Bao X Q, Zhang D W, et al. The anti-neuroinflammatory effects of dehydromiltirone and related mechanisms [J].ChinPharmacolBull, 2016,32(2): 177-83.

        [14] Woo H J, Lee J Y, Park H S, et al. Anti-inflammatory action of 2-carbomethoxy-2, 3-epoxy-3-prenyl-1, 4-naphthoquinone (CMEP-NQ) suppresses both the MyD88-dependent and TRIF-dependent pathways of TLR4 signaling in LPS-stimulated RAW264. 7 cells [J].JEthnopharmacol, 2017,205: 103-15.

        [15] 雷升萍, 王 靚, 龍子江, 等. 黃精多糖通過 TLR4-MyD88-NF-κB 通路抑制缺氧/復(fù)氧 H9c2 心肌細(xì)胞炎性因子釋放[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào), 2017,33(2), 255-60.

        [15] Lei S P, Wang L, Long Z J, et al. Inhibitory effect of polygonatum sibiricum polysaccharides release of inflammatory cytokines of anoxia/reoxygenation H9c2 myocardial cells through TLR4-MyD88-NFκB signaling pathway [J].ChinPharmacolBull, 2017,33(2), 255-60.

        猜你喜歡
        抗炎炎性化合物
        碳及其化合物題型點(diǎn)擊
        碳及其化合物題型點(diǎn)擊
        中西醫(yī)結(jié)合治療術(shù)后早期炎性腸梗阻的體會
        秦艽不同配伍的抗炎鎮(zhèn)痛作用分析
        牛耳楓提取物的抗炎作用
        中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:20
        短柱八角化學(xué)成分及其抗炎活性的研究
        中成藥(2017年10期)2017-11-16 00:50:09
        例析高考中的鐵及其化合物
        術(shù)后早期炎性腸梗阻的臨床特點(diǎn)及治療
        炎性因子在阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制中的作用
        熏硫與未熏硫白芷抗炎鎮(zhèn)痛作用的對比研究
        中藥與臨床(2015年5期)2015-12-17 02:39:30
        av一区二区三区有码| 色欲人妻综合网| 免费看久久妇女高潮a| 91爱爱视频| 好爽要高潮了在线观看| 亚洲成av人片极品少妇| 亚洲中文字幕日产无码| 亚洲av午夜国产精品无码中文字| 欧美综合自拍亚洲综合图片区 | 色婷婷av一区二区三区不卡| 亚洲天堂av福利在线| 国产精品国产精品国产专区不卡 | 女局长白白嫩嫩大屁股| 国产精品无套内射迪丽热巴| 久久亚洲国产精品五月天| 精品国产3p一区二区三区| 人妻一区二区三区av| 欧美国产综合欧美视频| 少妇被躁爽到高潮无码文| 超碰观看| 今井夏帆在线中文字幕| 国产高清在线精品一区app| 国产成人无码a区在线观看视频| 亚洲精品乱码久久久久久麻豆不卡| 亚洲成av在线免费不卡| 精品国产黄一区二区三区| 亚洲精品色午夜无码专区日韩| 亚洲精品国产福利一二区 | 本道无码一区二区久久激情| 色视频日本一区二区三区| 所有视频在线观看免费| 成年女人色毛片| 久久久国产精品樱花网站| 精品人妻一区二区久久| 少妇爽到高潮免费视频| 国产超碰女人任你爽| 久久精品国产精品亚洲毛片 | 少妇精品久久久一区二区三区| 白白青青视频在线免费观看 | 99久久婷婷国产综合精品青草免费| a级黑人大硬长爽猛出猛进 |