陳雨虹，戴 敏，梅曉冬

中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)是一種存在于中性粒細胞嗜天青顆粒中的絲氨酸蛋白酶，基因結構為ELA2,是在19號染色體短臂末端區(qū)域內含50個堿基的片段，含有218種氨基酸和4個二硫鍵，是絲氨酸蛋白酶家族的一份子。當中性粒細胞暴露于各種細胞因子和趨化因子刺激下時可釋放NE，如腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素IL-8、C5a、細菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和來自細菌壁FMLP的三肽[1]。

他汀類藥物是羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，是有效的降脂藥物，目前廣泛應用于心血管疾病的治療。但近年來許多研究[2]顯示，他汀類藥物還具有顯著的免疫調節(jié)和抗炎效用。他汀類藥物的多效性引起廣泛的關注。他汀藥物抗炎效用的機制具體包括有抗金屬蛋白酶作用、抗氧化作用、抗炎癥作用、抑制黏附分子表達、降低C反應蛋白水平等。其中蛋白水解酶的過度活化，是組織器官損傷的一條重要因素，包括組織蛋白酶，NE和金屬基質蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)， Kamio et al[3]研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可以通過HMG-CoA還原酶途徑抑制成纖維細胞釋放MMP，參與細胞炎癥過程。但目前尚無他汀類藥物是否能抑制人NE活化和過量釋放的相關作用研究。該研究在體外以LPS刺激中性粒細胞釋放NE，加入普伐他汀鈉進行干預，了解普伐他汀鈉是否可以抑制NE的釋放，為他汀類藥物多方面應用于臨床治療提供實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料與試劑TBD淋巴細胞分離液(天津灝洋公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基和雙抗(美國Hyclone公司 )；D-Hanks液、紅細胞裂解液、DMSO、HEPES(北京索萊寶公司)；胎牛血清(天津康源公司)；Trueline 24孔和96孔細胞培養(yǎng)板；LPS、普伐他汀鈉、Brij、純化NE(美國sigma公司)；POX染液、瑞氏-姬薩姆復合染液(臺灣BASO公司)；髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)測試盒(南京建成生物公司)；Methoxysuccinyl-alanyl-alanyl-prolyl-valyl paranitroanilide (MEOSAAPVNA)(美國SANTA公司)；人PMN Elastase ELISA試劑盒(美國Abcam公司)；紫外分光光度計(美國Beckman公司)；酶標儀(美國Thermo公司)。

1.2實驗方法

1.2.1人外周血中性粒細胞提取、培養(yǎng)及分組處理 采用Ficoll密度梯度離心法[4]分離培養(yǎng)人外周血中性粒細胞：取健康人群體檢靜脈全血4 ml(體檢人群年齡段為18～60周歲，血標本常溫放置不超過4 h，EDTA抗凝，血液標本由安徽省立醫(yī)院檢驗科提供)。取滅菌15 ml離心管，加入4 ml淋巴細胞分離液，在分離液上層緩慢加入全血標本，放入離心機，24 ℃、1 650 r/min ，離心25 min。離心后取出，此時離心管內液體分4層，從上往下分別是血漿層、淋巴細胞層、分離液層、紅細胞層，其中中性粒細胞在管底。小心吸去上面三層，加入紅細胞裂解液?；靹颍缓箅x心管置于冰盒中裂解15 min，期間需搖動混勻2次。然后1 500 r/min 離心10 min，取出后吸去上清液，不破壞管底沉淀。再加入紅細胞裂解液重復裂紅4次，1 000 r/min離心5 min，直至沉淀無可見紅色。加入D-Hanks液重懸洗滌，放入離心機1 000 r/min離心5 min，棄上清液，重復洗滌1次離心。棄上清液，加入細胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基)，吹打混勻，取10 μl細胞混勻液加入細胞計數(shù)板進行計數(shù)，記錄細胞總數(shù)。稀釋細胞濃度至5×105個/ml接種于24孔板中，放入CO2培養(yǎng)箱，恒溫37 ℃，孵育48 h。實驗分組：普伐他汀鈉組(0.5 mmol/L普伐他汀鈉)；普伐他汀鈉+LPS組(0.5 mmol/L普伐他汀鈉+1 mg/L LPS)；LPS組(1 mg/L LPS)；正常對照組(未加藥)。普伐他汀鈉和LPS均為每孔各0.2 ml，細胞鋪板時加入。

1.2.2瑞氏染色法鑒定中性粒細胞 參考血涂片瑞氏染色法進行改良，按上述方法提取中性粒細胞，D-Hanks液重懸后，吸取一滴細胞懸液滴片，自然晾干后甲醇固定液一滴覆蓋，晾干后染色：晾干玻片上加瑞氏姬薩姆復合染液15～20滴覆蓋玻片，10 s后加水稀釋染液，染液和水比例為1 ∶3，混勻，定時3 min，細流水沖洗，晾干，油鏡下觀察。

1.2.3MPO活性檢測 采用比色法測定MPO活性(南京建成生物公司)，按試劑盒說明書提取細胞上清液樣本，按比例稀釋檢測。測定原理：中性粒細胞為終末細胞，體外培養(yǎng)時細胞不斷死亡裂解，過氧化物酶顆粒釋放入細胞上清液，取細胞培養(yǎng)液離心后取上清液稀釋，加入H2O2，充分混勻后37 ℃水浴30 min，再加入AH2，通過供氫體鄰連茴香胺供氫后生成黃色化合物，在460 nm處通過比色測定產(chǎn)物吸光度，從而推算出MPO的活力及H2O2減少的量和白細胞的數(shù)目。

1.2.4NE活性檢測 參照Betsuyaku et al[5]的實驗方法，采用比色法測定各組上清液中NE的活性。MEOSAAPVNA是NE的一種敏感性的合成底物。準備一個96孔板，加入0.1 ml底物溶液和0.08 ml的樣本，底物溶液配比：0.2 mmol/L的MEOSAAPVNA，0.1 mol/L的HEPES，0.5 mol/L的NaCl，0.1%的Brij和2%的DMSO，溶液pH值調至7.5。以純化的彈性蛋白酶標準品做標準曲線，樣本稀釋后加入已鋪好底物溶液的96孔板中，室溫(25 ℃)孵育2 h，酶標儀設定405 nm處檢測各孔吸光度，根據(jù)NE不同濃度梯度繪制的標準曲線推算出樣本中NE活性水平。

1.2.5ELISA法檢測細胞上清液中NE含量 按人PMN Elastase ELISA試劑盒說明書操作，細胞培養(yǎng)液從24孔板中提取后離心去除細胞沉淀，取上清液，按說明稀釋，試劑盒所有溶液平衡至室溫，洗板2次，加入0.1 ml標準品和樣本，膠粘劑薄膜覆蓋，室溫25 ℃孵化1 h(振蕩器混勻)，再洗板4次，加入HRP Conjugated Antibody 繼續(xù)孵育1 h，去蓋洗4次，加入TMB Substrate Solution，避光孵育20 min，酶標儀620 nm處檢測最高標準品OD值為0.9～0.95時，立刻加入終止液停止反應。450 nm處檢測吸光度值。使用四參數(shù)擬合法結合標準曲線值推算樣本濃度值。

2 結果

2.1瑞氏染色結果成功提取純化人外周血中性粒細胞，改良瑞氏染色后，鏡下觀察均為多形核白細胞，核深染深紫色，胞質淡粉紅色，均可見顆粒狀物質。見圖1。

圖1 中性粒細胞提取后瑞氏染色 ×400

2.2LPS刺激中性粒細胞釋放MPO外周血中性粒細胞為終末細胞，從骨髓釋放入血后停留6～8 h，隨后進入組織可存活3～5 d，為研究證實LPS刺激中性粒細胞釋放MPO顆粒的作用，實驗以1 mg/L的LPS刺激體外培養(yǎng)的中性粒細胞[6]，在不同的時間點檢測MPO水平變化，結果顯示：LPS在體外可以刺激中性粒細胞釋放MPO。與正常對照組相比，LPS組在作用48 h后對細胞中MPO水平刺激達到最大，差異有統(tǒng)計學意義(F=23.55，P<0.01)。未加藥的正常對照組MPO水平隨時間增加逐漸上升，符合細胞自然死亡裂解趨勢。LPS組在48 h前MPO逐漸上升，之后下降，可能由藥物起效時間導致，因此后續(xù)實驗中的LPS組選用1 mg/L的LPS作用48 h。見圖2。

圖2 LPS刺激后細胞上清中MPO活力比較

2.3普伐他汀鈉對MPO活性的影響根據(jù)以上2.1中的實驗結果，以1 mg/L的LPS刺激細胞48 h作為對照組，同時加入不同濃度的普伐他汀鈉(0.1、0.5、1、2 mmol/L)進行干預，以同樣方法測定上清液中MPO活性。檢測結果顯示：與對照組相比，普伐他汀鈉在濃度為0.5 mmol/L時對MPO活性抑制作用最大，且差異有統(tǒng)計學意義(F=14.34，P<0.01)。見圖3。

圖3 不同濃度普伐他汀鈉對MPO活性的影響

A：對照組；B：普伐他汀鈉0.1 mmol/L組；C：普伐他汀鈉0.5 mmol/L組；D：普伐他汀鈉1 mmol/L；E：普伐他汀鈉2 mmol/L組；與對照組比較：**P<0.01

2.4普伐他汀鈉對NE活性和含量的影響根據(jù)2.1和2.2測得的實驗結果，將細胞分4組處理：普伐他汀鈉組；普伐他汀鈉+LPS組；LPS組；正常對照組。普伐他汀鈉和LPS均為每孔各0.2 ml，細胞鋪板時加入。比色法和ELISA法檢測細胞上清液中NE活性及含量，跟正常對照組相比，LPS組NE活性和含量都明顯升高，加入普伐他汀鈉后明顯降低，單獨加入普伐他汀鈉組也可顯著降低，且差異均有統(tǒng)計學意義(NE活性：F=60.910，P<0.01；NE含量：F=118.354，P<0.01)。NE活性及含量在4個處理組中降低和升高的趨勢大致相同。見圖4。

圖4 NE含量及活性表達

A：普伐他汀鈉組；B：普伐他汀鈉+LPS 組；C：LPS 組；D：正常對照組；與正常對照組比較：**P<0.01；與LPS組比較：△△P<0.01

3 討論

中性粒細胞是參與慢性氣道炎癥反應的最主要的細胞之一，可通過釋放蛋白酶等多種活性物質直接或間接損傷氣道組織[7]。MPO主要存在于中性粒細胞中，是嗜中性粒細胞中嗜天青顆粒釋放的標志酶，其含量多少與中性粒細胞的數(shù)目成正比[8]。中性粒細胞活化后釋放MPO，在肺組織及外周血中均可檢測到MPO活性顯著增高。因此MPO的相關檢測可以反應出中性粒細胞嗜天青顆粒的釋放水平。NE主要由中性粒細胞中嗜天青顆粒釋放，此外還有巨噬細胞、少量的單核細胞和T細胞也可釋放NE。中性粒細胞中NE濃度可超過5 mmol/L，每個成熟粒細胞中大約含有400個陽性顆粒[9]。NE具有強效的殺菌活性，并且可以協(xié)助活化的中性粒細胞吞噬病原體。此外，NE可以間接促進上皮細胞釋放有效的抗蛋白酶抗菌劑如彈力素(Elafin)，SLPI和人β-防御素-2的表達幫助宿主消滅病原體[10]。然而，中性粒細胞又是一把雙刃劍，中性粒細胞釋放NE與多種炎癥性疾病有關，中性粒細胞在脫離循環(huán)后不會存活很久，然而在慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary，COPD)等患者長期慢性的肺部炎癥刺激下可以延長其在肺組織中的存活時間。過高濃度的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的釋放和IL-10的相對缺乏，可以促進中性粒細胞凋亡，而NE能特異性地破壞巨噬細胞吞噬凋亡中性粒細胞的功能，導致大量凋亡中性粒細胞壞死釋放更多NE及有害物質進入肺組織[11]。此外，NE還可以誘導氣道上皮細胞黏蛋白的生產(chǎn)及杯狀細胞化生，造成氣道黏液高分泌狀態(tài)，為細菌生長提供有利條件。

通過對COPD患者各種炎癥標志物的監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，由中性粒細胞和巨噬細胞產(chǎn)生的MMP和NE與COPD炎癥作用機制密切相關，這兩種酶不僅影響蛋白酶水解，而且能持續(xù)調節(jié)炎癥反應[12]。在COPD患者氣道、肺泡灌洗液、誘導痰及外周血中均可以檢測到MMP和NE水平有不同程度的升高。研究[13]證實COPD患者急性期血清NE水平顯著升高，NE的表達與COPD的臨床分期有關,急性加重期NE水平高于穩(wěn)定期,且與COPD的臨床分級有關。COPD患者每一次急性加重，都離不開肺部感染這個重要因素，炎癥細胞大量募集，細胞炎癥因子及組織蛋白酶的大量釋放均導致肺氣腫呈進行性加重，且肺泡組織結構破壞后是不可逆的，在此過程中，NE扮演了一個重要的角色。因此降低COPD患者NE水平對于改善氣道重塑，延緩肺氣腫進展有非常重要的意義。

目前他汀類藥物對COPD患者的療效意見尚不統(tǒng)一，Criner et al[14]通過一項大型前瞻性、多中心、隨機對照試驗研究證明辛伐他汀對中度及重度COPD急性加重頻率沒有影響，而Raymakers et al[15]的一項基于人群的隊列研究調查了他汀類藥物的使用或可降低COPD患者全因死亡率和肺相關死亡率，同時有相關回顧性研究[16]表明他汀類藥物可降低COPD惡化率和嚴重程度，減少患者住院率和死亡率。目前各類研究對COPD療效評價的指標不同，COPD是一種慢性疾病，多數(shù)還伴有全身炎癥反應及其他系統(tǒng)疾病，臨床研究中有無法避免的干擾因素存在，且在不同研究中患者入選標準及他汀類藥物作為COPD輔助用藥的療程及劑量不同，這些都有可能是研究結果出現(xiàn)分歧的原因。而許多動物模型及體外實驗受到的干擾較小，因此可以從多方面證實他汀藥物的多效性。

本研究結果顯示，LPS可以刺激體外培養(yǎng)的中性粒細胞釋放胞內嗜天青顆粒，檢測上清液中MPO及NE水平隨之升高，而加入普伐他汀鈉可以顯著降低MPO及NE水平，從抗蛋白酶作用的方面提示了他汀藥物的又一條效用，為他汀類藥物或可應用于COPD輔助治療，改善患者預后提供了新的依據(jù)。但體外細胞水平研究有局限性，未能結合組織病理及臨床病例證實研究結論，有待在今后的研究中進一步完善實驗對象及方法進行深入探索。

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