鄭昌志，王 娟，齊向明，吳永貴

終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)是最常見(jiàn)的致死性疾病之一，血液透析(hemodialysis,HD)是主要的腎臟替代治療方法。即便透析技術(shù)已有所改善，但HD患者的死亡率仍舊較高。有研究[1]表明，與健康人群相比，行HD的ESRD患者死亡率較高的主要原因是心血管并發(fā)癥，包括冠心病、心力衰竭和外周血管疾病 。據(jù)報(bào)道[2]，載脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)是一些心血管疾病(如心肌梗死和冠狀動(dòng)脈疾病)的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素。作為一種主要的人體蛋白，ApoE的主要作用是通過(guò)與低密度脂蛋白(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)受體相互作用來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平和脂質(zhì)攝入。ε 2、ε 3和ε 4為ApoE最常見(jiàn)的的三個(gè)多態(tài)性等位基因，分布頻率分別為8.4%、77.9%和13.7%，這三種等位基因分別代表ApoE的E2、E3和E4的三個(gè)同構(gòu)體[3]。ApoE基因多態(tài)性與多種疾病相關(guān)，如2型糖尿病、心血管疾病，阿爾茨海默病等，且已有報(bào)道指出ApoE的ε 4等位基因與總膽固醇(total cholesterol，TC)和LDL-C的高水平有一定關(guān)聯(lián)[4]。然而，ApoE基因多態(tài)性對(duì)ESRD接受維持性血液透析(maintenance hemodialysis，MHD)患者的心血管并發(fā)癥的影響卻鮮有報(bào)道。該研究旨在了解ApoE基因多態(tài)性與ESRD MHD患者心血管并發(fā)癥之間的關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1病例資料選取2014年6月～2017年6月于我院行MHD治療的189例ESRD患者，所有患者使用聚砜膜透析器(天津海迪尼國(guó)際貿(mào)易有限公司，天津，中國(guó))和碳酸氫鹽透析液(透析液流量：500 ml/min，血流量：200～250 ml /min)進(jìn)行規(guī)律透析，通路為中心靜脈導(dǎo)管或動(dòng)靜脈內(nèi)瘺，透析頻率為每周3次，每次約4 h。其中男103例，女86例，男女比例1.2 ∶1；年齡25～75(46.21±9.40)歲。入選標(biāo)準(zhǔn)如下：① 滿足ESRD診斷標(biāo)準(zhǔn); ② 入組前2個(gè)月內(nèi)無(wú)急性感染、手術(shù)和創(chuàng)傷史; ③ 無(wú)嚴(yán)重的心臟，腦，肺，肝臟疾病; ④ 無(wú)嚴(yán)重出血傾向或輸血史；⑤ 除腎性貧血外，無(wú)其他血液疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)如下：① 本研究期間接受不規(guī)則血液透析的患者;② 懷孕或正在育嬰期的患者;③ 合并低血壓患者；④ 腫瘤、嚴(yán)重心功能不全、活動(dòng)性肝炎和風(fēng)濕性疾病的患者。原發(fā)病組成為：慢性腎小球腎炎58例，糖尿病性腎病47例，良性小動(dòng)脈腎硬化33例，15例慢性間質(zhì)性腎炎，腎盂腎炎9例，多囊腎7例，痛風(fēng)性腎病4例，2例梗阻性腎病，14例原因不明確。同期選取165名健康人群作為對(duì)照組，其中男90例，女75例，年齡23～72(45.12±9.09)歲。兩組間年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2方法

1.2.1臨床觀察與生化檢測(cè) 抽取對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組透析前空腹靜脈血，檢測(cè)血脂，通過(guò)ELISA法檢測(cè)脂聯(lián)素，酶測(cè)試法測(cè)血肌酐(serum creatinine，Scr)和尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)，脂質(zhì)法分別檢測(cè)TC、三酰甘油(triglyceride ，TG)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、LDL-C，通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血清白蛋白(serum albumin，ALB)。觀察實(shí)驗(yàn)組患者行HD后的心血管并發(fā)癥：如低血壓、高血壓、冠心病及慢性心功能不全。采用WHO標(biāo)準(zhǔn)[5]診斷低血壓和高血壓；明尼蘇達(dá)州標(biāo)準(zhǔn)[6]用于診斷冠心病；Framingham心力衰竭診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]診斷慢性心功能不全。

1.2.2PCR-RFLP 通過(guò)PCR-RFLP檢測(cè)位于第四外顯子中的ApoE基因；收集每位受試者外周靜脈血(3～5 ml)，采用1%乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的常規(guī)酚法提取DNA。將DNA濃度稀釋至10 ng/μl。通過(guò)PCR-RFLP檢測(cè)位于第四外顯子中的ApoE基因。由Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物；上游引物：5′-AACAACTGACCCCGGTGGCG-3′；下游引物：5′-ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC-3′。PCR反應(yīng)體系為25 μl。 PCR擴(kuò)增條件為：Stage1預(yù)變性：95 ℃ 5 min；Stage2循環(huán)反應(yīng)：95 ℃ 30 min，65 ℃ 30 min，72 ℃ 30 min；(循環(huán)45次)；Stage3延伸階段：72 ℃ 10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至0.5 ml無(wú)菌管中，加入0.5 μl Hhal酶(10 U/μl)后充分振蕩。離心一段時(shí)間后，將無(wú)菌管在37 ℃水浴箱中放置3 h以上。收集總共10 μl的酶水解產(chǎn)物，以8%聚丙烯酰胺凝膠電泳(19 ∶1)，在120 V的條件下進(jìn)行電泳90 min。使用溴化乙錠進(jìn)行染色，并在紫外燈下觀察結(jié)果。

1.2.3ApoE基因型及等位基因分布頻率 根據(jù)ApoE的不同基因型，將其分為3組：ε 2組(ε 2/ 2和ε 4/ 2基因型)；ε 3組(ε 3/ 3和ε 3/ 2基因型); ε 4組(ε 4/ 3和ε 4/ 4基因型)。使用印跡雜交法檢測(cè)ApoE基因型，比較不同基因型的基線特征及等位基因分布頻率，并觀察與心血管并發(fā)癥的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組生化指標(biāo)比較實(shí)驗(yàn)組脂聯(lián)素、Scr、BUN、TC、LDL-C及TG顯著高于對(duì)照組，HDL-C和ALB均明顯偏低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP) PCR-RFLP檢測(cè)法鑒定ApoE的6種常見(jiàn)基因型，基因名稱及所包含片段長(zhǎng)度如下：含兩個(gè)片段的ε 3/3基因型(91 bp、48 bp)、ε 4/4基因型(72 bp和48 bp)、ε 2/2基因型(91 bp、83 bp); 含有三個(gè)片段的ε 4/3基因型(91 bp、72 bp和48 bp)、ε 3/2基因型，(91 bp，83 bp和48 bp)、ε 4/2基因型(91 bp，83 bp和48 bp)。各片段經(jīng)PCR擴(kuò)增及Hhal酶水解后進(jìn)行凝膠電泳，見(jiàn)圖1。

2.3實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組ApoE基因型和等位基因分布頻率Hardy-Weinberg平衡表明，兩組樣本實(shí)際基因型和理論基因型的頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且基因型的分布具備遺傳均衡的群體代表性，其中ε 3/3和ε 4/3基因型在兩組中出現(xiàn)頻率最高，其次是ε 2/2和ε 4/2，而ε 4/4和ε 3/2為最低。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中ε 3/3和ε 3明顯下降，而ε 4/3和ε 4明顯上升(均P<0.05)，說(shuō)明ε 3/3和ε 3是ESRD MHD患者心血管并發(fā)癥的保護(hù)性因素，而ε 4/3和ε 4則為危險(xiǎn)性因素。兩組間其他基因型和等位基因的分布頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各生化指標(biāo)比較

表2 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組ApoE基因型和等位基因頻率的比較

表3 ApoE基因型與ESRD MHD患者在ε 2、ε 3和ε 4組的基線特征之間的關(guān)系

與ε 2組比較：*P<0.001;與ε 3組比較：#P<0.001

圖1 PCR-RFLP檢測(cè)ApoE基因型

2.4ApoE基因型與ESRDMHD患者在ε2、ε3和ε4組的基線特征之間的關(guān)系患者在年齡、性別、ALB、TG和LDL-C的濃度在不同ApoE基因型中無(wú)明顯差異(均P>0.05)。ε 4組中脂聯(lián)素，Scr、BUN、TC均高于其他組，而ε4組HDL-C低于其他組(P<0.05)。 ε 3組與ε 2組比較，HDL-C水平較高，脂聯(lián)素、Scr、BUN、TC水平較低(均P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.5ESRD行MHD患者心血管并發(fā)癥發(fā)生率及與在ε2，ε3和ε4組ApoE基因型的相關(guān)性與其他組患者相比，ε 4組的MHD患者更可能患有低血壓，高血壓，冠心病和慢性心功能不全的并發(fā)癥(均P<0.05)。ε 3組患者在ε 2和ε 4組患者中心血管并發(fā)癥更少(均P<0.05)。見(jiàn)表4。

2.6MHD患者心血管并發(fā)癥的危險(xiǎn)因素以心血管并發(fā)癥作為獨(dú)立變量行二元邏輯回歸分析，因變量中有心血管并發(fā)癥賦值1，無(wú)心血管并發(fā)癥賦值0；自變量：基因型自變量，ε 3組基因型賦值0，ε 4組基因型賦值1；脂聯(lián)素、Scr、BUN、TC、HDL-C等自變量均為數(shù)值變量。結(jié)果證實(shí)ε 3和ε 4組的基因型與尿毒癥血透患者的心血管并發(fā)癥相關(guān)，ε 3及ε 3/ 3是其保護(hù)性因素，而ε 4與ε 4/ 3則為危險(xiǎn)性因素(均P<0.05)；而其他指標(biāo)不是其危險(xiǎn)性因素(均P>0.05)。見(jiàn)表5。

表4 ESRD MHD患者在ε 2，ε 3和ε 4組ApoE基因型心血管并發(fā)癥發(fā)生率

與ε 2組比較：*P<0.05; 與ε 3組比較：#P<0.05

表5 Logistic回歸分析ESRD患者心血管并發(fā)癥的危險(xiǎn)因素

3 討論

3.1ESRDMHD患者生化指標(biāo)實(shí)驗(yàn)組中脂聯(lián)素、Scr、BUN、TC、TG、LDL-C明顯高于對(duì)照組，而ALB和HDL-C均低于對(duì)照組。有研究[8]證實(shí)，血漿脂聯(lián)素水平取決于腎功能，BUN和Scr升高提示腎功能損害，腎功能損害患者脂聯(lián)素水平明顯增加；高水平LDL-C、高TC和TG可導(dǎo)致腎損傷，且LDL-C水平升高是日本男性患慢性腎臟疾病的獨(dú)立因素[9]，故脂質(zhì)代謝可通過(guò)影響腎臟功能，進(jìn)而影響脂聯(lián)素、Scr及BUN的水平。

3.2ApoE基因型和ESRDMHD患者在ε2、ε3和ε4組的基線特征及等位基因分布頻率本研究顯示ε 4組的脂聯(lián)素，Scr、BUN和TC水平均高于其他組，而HDL-C水平低于其他組。ε 3組與ε 4組相比則具有相反的趨勢(shì)。腎小球硬化是致使Scr和BUN水平升高的基礎(chǔ)，而ApoE則與腎小球硬化的進(jìn)展相關(guān)[10]。一項(xiàng)有關(guān)健康人血肌酐水平與ApoE多態(tài)性關(guān)聯(lián)性的研究表明ApoE攜帶者(ε 4/3和ε 4/4)傾向于具有最低的Scr水平[11]。 因ε 4 基因在脂肪細(xì)胞中明顯具有較高的表達(dá)率[12]，既往研究證實(shí)ε 4可增加個(gè)體脂肪攝入中LDL-C水平，降低HDL-C水平[13]，含有ε 4的個(gè)體，TC和LDL-C水平明顯高于其他個(gè)體，反之HDL-C水平則較低[14]。另外，本研究中實(shí)驗(yàn)組中ε 3/3及ε 3的分布頻率明顯低于對(duì)照組，反之ε 4/3和ε 4則顯著偏高。且現(xiàn)已均知高水平LDL-C可增加心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，HDL-C因可提取組織內(nèi)膽固醇并轉(zhuǎn)移致肝臟代謝排出則益于心血管系統(tǒng)和腎功能[15]。綜上可知，ε 4及ε 4/3可被認(rèn)為是ESRD MHD患者心血管并發(fā)癥的危險(xiǎn)性因素。與本研究一致的是Dekroon et al[16]曾報(bào)道，ε 4等位基因通過(guò)改變脂質(zhì)成分代謝使心血管疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高。

3.3ESRD行MHD患者心血管并發(fā)癥發(fā)生率及與在ε2、ε3和ε4組ApoE基因型的相關(guān)性通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可知，ε 4組患者的ESRD MHD患者更有可能出現(xiàn)低血壓，冠心病和慢性心功能不全的并發(fā)癥，而ε 3組患者的并發(fā)癥發(fā)生率則較低。以往研究證實(shí)血漿脂質(zhì)升高是心血管疾病的主要風(fēng)險(xiǎn)，ApoE多形性通過(guò)其他生物化學(xué)途徑影響血漿中的脂質(zhì)組成和心血管疾病進(jìn)展；ε 4等位基因增加認(rèn)知衰退、中風(fēng)、高血壓和冠狀動(dòng)脈疾病的風(fēng)險(xiǎn)[17]。此外，本研究回歸分析表明，ε 3/3及ε 3是ESRD MHD患者心血管并發(fā)癥的保護(hù)性因素，ε 4/3和ε 4是相關(guān)危險(xiǎn)性因素。盡管多項(xiàng)研究表明ε 4等位基因是心血管并發(fā)癥的一項(xiàng)高危因素，然而ε 3等位基因在某些疾病中的保護(hù)作用仍有待進(jìn)一步探索。

總之，本研究證實(shí)ApoE基因多態(tài)性對(duì)ESRD MHD患者心血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展具有一定的影響及ε 4基因型和其等位基因可增加此類患者發(fā)生心血管并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，為預(yù)防和治療ESRD MHD患者的心血管并發(fā)癥提供了臨床意義。但因本實(shí)驗(yàn)受樣本量較小的限制，未來(lái)則需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步探索ApoE基因多態(tài)性對(duì)ESRD MHD患者心血管并發(fā)癥的影響。

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