龔義飛，張 超，何新苗，駱會(huì)來(lái)，張慧平，張 沖

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是一種慢性炎性反應(yīng)過(guò)程，研究[1]顯示乙型肝炎等病毒、自身免疫性肝損害、酒精肝等多種因素會(huì)導(dǎo)致肝臟內(nèi)多種炎性細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素(interleukin 1，IL-1)、IL-6等釋放增多，從而導(dǎo)致匯管區(qū)內(nèi)纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞( hepatic stellate cell ，HSC)轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞，激活的成纖維細(xì)胞、HSC會(huì)分泌大量的膠原蛋白，彌漫性分布于肝細(xì)胞內(nèi)，最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)增多、肝功能受損、肝臟纖維化以及肝硬化。研究[2]表明肝纖維化具有可逆性，大量藥物應(yīng)用于肝纖維化的防治，其中奧曲肽(octreotide ，OCT)可減輕多種因素導(dǎo)致的組織損傷，具有顯著的細(xì)胞保護(hù)作用。而維甲酸相關(guān)孤核受體α(retinoid-related orphan receptor α，RORα) 可能通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、參與炎性反應(yīng)等機(jī)制在肝纖維化發(fā)生中的可能起到了至關(guān)重要的作用[3]。該實(shí)驗(yàn)觀察OCT對(duì)用四氯化碳(CCl4)建立大鼠肝纖維化模型的肝細(xì)胞表達(dá)的影響，研究OCT是否通過(guò)減少RORα下降的程度來(lái)減輕大鼠肝細(xì)胞損害。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)選用成年清潔雄性SD大鼠36只，220～260 g(購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；CCl4(無(wú)錫展望化工試劑有限公司)及橄欖油(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，按容積比4 ∶6配制成40%混合溶液；OCT(0.1 mg/ml，瑞士Novartis Phama Schwaiz公司)用生理鹽水稀釋成0.1、1 mg/ml；透明質(zhì)酸( hyaluronic acid，HA)ELISA測(cè)定試劑盒和大鼠層粘連蛋白(Laminin，LN)ELISA測(cè)定試劑盒和大鼠Ⅲ型前膠原氨基端原肽(N-terminal procollagen Ⅲ propeptide，PⅢNP)ELISA測(cè)定試劑盒和大鼠Ⅳ型膠原(collagen Ⅳ，COL4)ELISA測(cè)定試劑盒(伊萊瑞特生物科技有限公司)；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒和ECL發(fā)光試劑(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；抗β-actin抗體以及二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)；抗α平滑肌蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，抗RORα一抗及單克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組及建立模型 大鼠正常喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組和OCT治療組，每組12只。模型組及OCT治療組的大鼠皮下注射40% CCl43 ml/kg，每周2次；OCT治療組的大鼠腹部皮下注射OCT 100 ng/100 g，每日2次；對(duì)照組和模型組均予以注射等量生理鹽水。給藥8周后處死大鼠并采集標(biāo)本。

1.2.2形態(tài)學(xué)及病理學(xué)觀察 取大鼠肝臟左葉大體觀察肝臟形態(tài)、質(zhì)地、色澤，甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋切片，行HE 和VG 染色。顯微鏡下觀察肝臟病理組織學(xué)改變及肝臟膠原纖維的情況，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)400倍的不連續(xù)視野，每個(gè)組別的炎癥活動(dòng)和肝組織纖維化程度通過(guò)Ishak評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析和比較，按評(píng)分及相應(yīng)的分值判定病情的輕重，即：A碎屑樣壞死(0～4 分)；B融合性壞死(0～6分)；C點(diǎn)狀壞死、凋亡小體和灶性炎癥(0～4 分)；D匯管區(qū)炎癥(0～4分)。該評(píng)分系統(tǒng)中，纖維化水平的分期標(biāo)準(zhǔn)是按肝組織纖維增生的程度給以相應(yīng)的分值(0～6分)[4]。

1.2.3肝臟血清學(xué)檢測(cè) 通過(guò)全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定大鼠血清肝功能谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)的含量，按照試劑盒說(shuō)明書操作通過(guò)ELISA法測(cè)定HA、LN、PⅢNP、COL4含量。

1.2.4Western blot法檢測(cè) 使用玻璃勻漿器將冷凍的大鼠肝細(xì)胞勻漿并且離心取上清液。BCA 法測(cè)定蛋白含量，統(tǒng)一樣本蛋白總量。按Western blot操作流程進(jìn)行檢測(cè)，用Quantity One軟件分析β-actin、α-SMA，RORα各條帶灰度值，差異性分析蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1大鼠肝臟大體標(biāo)本及病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果大體標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果：對(duì)照組大鼠肝臟表面顏色鮮紅，表面光滑，邊緣銳利，質(zhì)地柔軟；模型組大鼠肝臟表面出現(xiàn)結(jié)節(jié)狀改變，邊緣圓鈍，質(zhì)地較硬，色澤淺，纖維化明顯，；OCT治療組大鼠肝臟表面色澤較紅，邊緣較銳利，質(zhì)地較軟。病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果：對(duì)照組肝組織炎性細(xì)胞較少，罕見(jiàn)凋亡小體，極少量的膠原纖維分布于匯管區(qū)周圍，肝細(xì)胞條索狀排列結(jié)構(gòu)正常；模型組肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，匯管區(qū)及小葉纖維增生，肝細(xì)胞脂肪變性，同時(shí)伴有片狀壞死，伴有單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞浸潤(rùn)；OCT治療組可見(jiàn)肝細(xì)胞腫脹，氣球樣變，大量點(diǎn)狀壞死，少量碎片狀壞死，少量的肝組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)大多數(shù)細(xì)胞排列結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)小的膠原纖維圍繞著小血管和匯管區(qū)。見(jiàn)圖1。

2.2Ishak評(píng)分結(jié)果模型組及OCT治療組肝細(xì)胞炎癥活動(dòng)度及纖維化程度較對(duì)照組均明顯增高(P<0.01)；與模型組比較，OCT治療組評(píng)分有顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1、2。

2.3大鼠血清生化指標(biāo)及肝纖維化檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組比較，模型組和OCT治療組血清AST 、ALT 、HA、LN、PⅢNP、COL4含量水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，OCT治療組血清AST 、ALT 、HA、LN、PⅢNP、COL4含量水平顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

圖1 大鼠肝臟HE和VG染色結(jié)果 ×400

組別炎癥活動(dòng)度評(píng)分0～34～67～910～1415～18秩均值對(duì)照1200006.5模型0039128.46??OCT0273021.25??#H值-----28.990P值<0.01

與對(duì)照組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05

表2 大鼠肝臟纖維化程度Ishak評(píng)分

與對(duì)照組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05

2.4RORα蛋白檢測(cè)結(jié)果各組之間肝組織RORα蛋白表達(dá)量不完全相同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=37.79、45.99，P<0.01)。與對(duì)照組比較，模型組大鼠肝組織RORα蛋白的表達(dá)水平明顯下降(P<0.01)。OCT治療后，RORα蛋白表達(dá)水平明顯上升(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

3 討論

圖2 大鼠肝組織RORα蛋白表達(dá)量

與對(duì)照組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05

肝細(xì)胞損傷是肝臟纖維化形成的重要原因，一方面是間質(zhì)細(xì)胞，如HSC誘導(dǎo)肝纖維化的促進(jìn)因素，另一方面也是細(xì)胞因子，如TGF-b1促進(jìn)肝纖維化的重要因素[5]。而生長(zhǎng)抑素(somatostatin，SST)是一種環(huán)形14肽類激素，由下丘腦釋放，目前已廣泛應(yīng)用于重癥胰腺炎和肝硬化所致的上消化道出血等疾病的治療[6]，OCT 是SST 的一種衍生物，與SST 有類似的理化性質(zhì)，使用OCT 可以抑制循環(huán)中內(nèi)毒素的水平，并且下調(diào)循環(huán)中的炎癥介質(zhì)，有保護(hù)細(xì)胞的作用[7]。相關(guān)研究[8]表明，RORα可預(yù)防肝纖維化的發(fā)生，一方面，通過(guò)影響靶基因的表達(dá)，調(diào)控脂代謝過(guò)程中的重要物質(zhì)，保持脂代謝平衡。另一方面RORα在肝臟炎性反應(yīng)中也發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，其表現(xiàn)為抑制了肝臟的炎性反應(yīng)，減輕肝臟炎性反應(yīng)帶來(lái)的肝臟功能損傷[9]。HSC是肝臟纖維化形成的一種核心細(xì)胞，研究[5]表明，多種因素均可導(dǎo)致其增殖、活化及分泌ECM，參與肝纖維化的形成。其增殖的一個(gè)核心機(jī)制是活化Wnt信號(hào)通路[10]。而磷酸化后的RORα可減少各種轉(zhuǎn)錄輔助因子和RNA聚合酶Ⅱ在β連環(huán)蛋白(β-catenin)與相關(guān)靶向基因啟動(dòng)子結(jié)合處的聚合，進(jìn)而阻止Wnt/β-catenin信號(hào)的傳導(dǎo)，抑制β-catenin被激活，減少了相關(guān)產(chǎn)物基因的表達(dá)[11]，為RORα參與抗肝纖維化提供了可能。但RORα與奧曲肽抗肝臟纖維化中的具體關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CCl4建模的大鼠，病理可見(jiàn)肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，匯管區(qū)及小葉纖維增生，肝細(xì)胞脂肪變性，同時(shí)伴有片狀壞死，伴有單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞浸潤(rùn)。血清AST 、ALT 、HA、LN、PⅢNP、COL4含量水平明顯升高，RORα蛋白的表達(dá)水平明顯下降，使用 OCT治療后可見(jiàn)肝細(xì)胞腫脹，氣球樣變，伴有大量點(diǎn)狀壞死及少量碎片狀壞死，少量肝組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，大多數(shù)細(xì)胞排列結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)小的膠原纖維圍繞著小血管和匯管區(qū)。血清AST 、ALT 、HA、LN、PⅢNP、COL4含量水平顯著降低，RORα蛋白表達(dá)水平明顯上升。說(shuō)明OCT治療肝纖維化大鼠療效確切，同時(shí)減少了RORα下降的程度，也提示RORα具有抗肝纖維化的作用。

表3 大鼠血清生化指標(biāo)及肝纖維化檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05

[1] 張 碩.根皮苷抗血吸蟲病肝纖維化的作用及機(jī)制研究[D].長(zhǎng)沙：湖南師范大學(xué)，2012.

[2] Ancha H,Ojeas H,Tedesco D,et al.Somatostain-induced gastric protection against ethanol：involvement of nitric oxide and effects on gastric mucosal blood flow[J].Regul Pept,2003,110(2):107-13.

[3] Fitzsimmons R L,Lau P,Muscat G E.Retinoid-related orphan receptor alpha and the regulation of lipid homeostasis[J].J Steroid Biochem Mol Biol,2012,130(3/4/5)：159-68.

[4] Ishak K,Baptista A,Bianchi L,et al. Histological grading and staging of chronic hepatitis[J]. Hepatol,1995,22:696-9.

[5] 姚 磊,張 超,李方躍,等.奧曲肽對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠瘦素及功能性瘦素受體表達(dá)的影響[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2012,47(7):800-4.

[6] Zhang C，Xu J M，Kong D R，et al. Immediate effects of different schedules of somatostatin on portal pressure in patients with liver cirrhosis[J]. Clin Pharm Ther，2013,38(3):206-11.

[7] Wang G,Wen J,Wilbur R R,et al. The effect of somatostatin，ulinastatin and salvia miltiorrhiza on severe acute pancreatitis treatment[J]. Am J Med Sci,2013,346(5)：371-6.

[8] Jetten A M，Kang H S，Takeeda Y.Retinoic acid-related orphan receptors α and γ：key regulators of lipid/glucose metabolism,inflammation,and insulin sensitivity[J].Front Endocrinol(Lausanne),2013,4:1.

[9] McHedlidze T,Waldner M,Zopf S,et al.Interleukin-33-dependent innatelymphoid cells mediate hepatic fibrosis[J].Immunity,2013,39(2):357-71.

[10] Xiong W J,Hu L J,Jian Y C,et al.Wnt5a participates in hepatic stellate cell activation observed by gene expression profile and functional assays[J].World J Gastroenterol,2012,18(15):1745-52.

[11] 袁 燦.維甲酸相關(guān)孤核受體a抗肝纖維化作用研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2014,30(3):391-3.