許 麗， 李 妍， 王雪亮， 肖艷群， 劉 剛(. 上海市計(jì)量測試技術(shù)研究院 化學(xué)與電離輻射計(jì)量技術(shù)研究所， 上海 003;. 上海市臨床檢驗(yàn)中心 分子生物學(xué)室， 上海 006)

0 引 言

中國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)于2013年3月31日首次通報(bào)，上海市和安徽省發(fā)現(xiàn)3 例人感染H7N9 禽流感病例。該疫情由H7N9病毒引起，每年都會(huì)在冬春季出現(xiàn)季節(jié)性流行，肺炎為其主要臨床表現(xiàn)，患者常出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、咳痰，可伴有頭痛、肌肉酸痛、腹瀉或嘔吐等癥狀。重癥患者病情發(fā)展迅速，多在發(fā)病3～7 d出現(xiàn)重癥肺炎。H7N9病例早期發(fā)病無特異性表現(xiàn)，早診早治困難，后期重癥病例治療效果差，病死率高，目前報(bào)告病例的總體病死率在40%左右[1-3]。疫情發(fā)生后，國家衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì)、疾病預(yù)防控制中心及時(shí)發(fā)布《人感染H7N9禽流感疫情防控方案》《人感染H7N9禽流感醫(yī)院感染預(yù)防與控制技術(shù)指南》和《人感染H7N9禽流感診療方案》[4]，世界衛(wèi)生組織也于2013年4月發(fā)布《H7N9禽流感病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方案》[5]。

實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄 PCR 方法(Real-time Reverse-transcription PCR, Real-time RT-PCR)可直接檢測H7N9病原體 RNA，具有快速、特異性強(qiáng)且不受樣品新鮮度限制的優(yōu)點(diǎn)，且較常規(guī)PCR靈敏度更高、少污染、操作更便捷、反應(yīng)更快速，可以為疾病早診斷、早治療、降低病死率以及控制疫情爭取時(shí)間，因此已經(jīng)成為H7N9禽流感病毒檢測的重要方法。目前已有較多文獻(xiàn)報(bào)道使用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測 H7N9 病毒，也有相應(yīng)的試劑盒研制成功并投放市場[6-12]。

在實(shí)際的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測過程中，常因RNA抽提失敗、反轉(zhuǎn)錄效率低、PCR體系中存在抑制劑等因素容易造成假陰性結(jié)果，需要使用核酸或病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對其進(jìn)行質(zhì)量控制。但目前仍然沒有相關(guān)有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，各檢測單位在檢測時(shí)常采用病毒陽性樣本、提取的病毒RNA、非感染性體外轉(zhuǎn)錄RNA、自行研制的質(zhì)粒DNA分子或試劑盒自帶的陽性標(biāo)準(zhǔn)品作為質(zhì)控品，穩(wěn)定性差、存在安全隱患、陽性樣品難以獲取且缺乏統(tǒng)一的定值方法、量值無法溯源，造成各實(shí)驗(yàn)室之間的檢測結(jié)果差異大，缺乏可比性、有效性和可靠性。

本文以H7N9禽流感病毒為目標(biāo)研制了一種質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，包含H7N9實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方法的靶標(biāo)基因(血細(xì)胞凝集素HA基因和神經(jīng)氨酸酶NA基因)以及內(nèi)參基因(M基因、RnaseP基因)，適用于多種實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方法，并具有良好的序列準(zhǔn)確度和量值可溯源性，可用于H7N9禽流感病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測結(jié)果的質(zhì)量控制，保證檢測結(jié)果的可靠可比性，為其提供生物計(jì)量技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

限制性內(nèi)切酶、全基因人工合成等(寶生物工程有限公司)；引物探針合成、Master Mix(Life technologies)；人感染H7N9禽流感病毒RNA檢測試劑盒(上海之江生物科技股份有限公司)；H7N9禽流感病毒cDNA，贈(zèng)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院；DNA測序(寶生物生物工程有限公司、北京六合華大基因科技股份有限公司、上海百力格生物技術(shù)有限公司、鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司、上海立菲生物技術(shù)有限公司、上海美吉生物技術(shù)有限公司、上海生工生物技術(shù)有限公司、蘇州金唯智生物科技有限公司)。實(shí)驗(yàn)中用到的引物和探針序列見表1。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Life technologies)；微量核酸蛋白定量儀(nanodrop2000)；高分辨電感耦合等離子體質(zhì)譜(Thermo Element 2)。

表1 實(shí)驗(yàn)中的引物和探針序列[5]

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

在數(shù)據(jù)庫GISAID EpiFlu(http://platform.gisaid.org/epi3/frontend#4c6137)中查詢已經(jīng)報(bào)道的H7N9禽流感病毒基因組序列，下載后選取若干病毒株序列進(jìn)行比對。比對發(fā)現(xiàn)不同株病毒的序列有稍許變異，但是鑒于檢測H7N9的引物和探針多在其序列的較保守區(qū)域設(shè)計(jì)，且針對變異位點(diǎn)多設(shè)計(jì)了簡并堿基，所以選擇其中一株2013年在安徽省發(fā)現(xiàn)的病毒(isolate ID：EPI_ISL_138739)的序列進(jìn)行克隆。選取H7N9禽流感病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測的靶基因(H7、N9基因序列)、內(nèi)參基因(M基因)以及人類RnaseP基因序列，序列經(jīng)軟件分析后在5′端和3′端加上合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。將修改后的序列進(jìn)行全基因人工合成，并插入到克隆載體pMD19-T上，形成重組質(zhì)粒。提取純化后的重組質(zhì)粒送8家測序公司聯(lián)合測序驗(yàn)證，確認(rèn)靶基因序列被正確克隆。

1.3 質(zhì)粒純度、均勻性及穩(wěn)定性檢驗(yàn)、定值方法、不確定度分析

采用已發(fā)表的方法[13]對質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度進(jìn)行檢驗(yàn)，參照J(rèn)JF 1343-2012[14]及ISO Guide 35[15]對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的瓶間均勻性、瓶內(nèi)均勻性、短期穩(wěn)定性及長期穩(wěn)定性進(jìn)行檢驗(yàn)評價(jià)，并聯(lián)合多家實(shí)驗(yàn)室對質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度進(jìn)行定值。使用兩種方法對質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度進(jìn)行定值[13]，一種為紫外分光光度法；另一種為高分辨電感耦合等離子體質(zhì)譜，從三方面來源對質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度進(jìn)行分析：① 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不均勻性引起的不確定度；② 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在有效期內(nèi)的變動(dòng)性引起的不確定度；③ 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值過程帶來的不確定度，包括數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)引入的不確定度和通過對定值方法中測量影響因素進(jìn)行分析評定的不確定度。

1.4 質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測中的應(yīng)用性考察

采用兩種方式對質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的應(yīng)用性進(jìn)行考察：① 使用WHO推薦PCR方法對質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增；② 采用商業(yè)化H7N9禽流感病毒檢測試劑盒對質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增時(shí)采用H7N9禽流感病毒cDNA作為對照，觀察研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是否與病毒cDNA擴(kuò)增結(jié)果是否一致。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)粒構(gòu)建

選取H7N9禽流感病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測的靶基因(H7、N9基因序列)、內(nèi)參基因(M基因)以及人類RnaseP基因序列，全基因人工合成后克隆至載體pMD19-T上，形成重組質(zhì)粒pXL12。經(jīng)8家測序技術(shù)公司聯(lián)合驗(yàn)證，質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)pXL12的插入序列與設(shè)計(jì)克隆的H7基因、N9基因、M基因、RnaseP基因序列完全相符，準(zhǔn)確率為100%。重組質(zhì)粒圖譜見圖1，外源序列信息見表2。

2.2 質(zhì)粒純度檢測

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度法確認(rèn)，質(zhì)粒無其他DNA、RNA或蛋白質(zhì)污染，純度符合要求。電泳結(jié)果見圖2，紫外分光光度法檢測結(jié)果:質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)pXL12,A260/A2801.85,A260/A2302.06。

圖1 重組質(zhì)粒圖譜

泳道M: λ-HindⅢ digest DNA marker; 泳道1: 未經(jīng)酶切的環(huán)狀質(zhì)粒pXL12; 泳道2:經(jīng)KpnⅠ酶切后的線性質(zhì)粒 pXL12

2.3 質(zhì)粒均勻性及穩(wěn)定性檢驗(yàn)

經(jīng)隨機(jī)抽樣檢測及結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，本研究中的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的瓶內(nèi)均勻性、瓶間均勻性均符合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制要求[16]。經(jīng)短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)，該質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在20 ℃下保存10 d，量值保持穩(wěn)定；經(jīng)長期穩(wěn)定性檢驗(yàn)，該質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在-20 ℃條件下保存，在12個(gè)月內(nèi)量值保持穩(wěn)定。

2.4 質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值和不確定度評估

研制的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采用9家實(shí)驗(yàn)室協(xié)同定值，匯總?cè)吭紨?shù)據(jù)后經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)確認(rèn)各組數(shù)據(jù)無離群值、各組數(shù)據(jù)等精度、每組數(shù)據(jù)的平均值之間不存在顯著性差異后，取9家實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果的平均值為各質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值。

隨后對質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度進(jìn)行評估，將均勻性引入的不確定度、穩(wěn)定性引入的不確定度、定值過程引入的不確定對分量合成，得到最終質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度度。將質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值標(biāo)準(zhǔn)值的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子k(對應(yīng)置信概率95%，取k=2)，即為質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值標(biāo)準(zhǔn)值的擴(kuò)展不確定度。質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度分量為：質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)pXL12，不均勻性引起的相對不確定度0.07%，在有效期內(nèi)的變動(dòng)性引起的相對不確定度0.4%，定值過程引入的相對不確定度1.2%，相對合成不確定度1.3%，標(biāo)準(zhǔn)不確定度1.35 mg/L。定值結(jié)果為：質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)pXL12，定值結(jié)果104.0 ng/μL，DNA拷貝數(shù)濃度1.3×1010copies/μL，標(biāo)準(zhǔn)不確定度1.35 mg/L，相對擴(kuò)展不確定度(k=2)2.6%。

2.5 質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測中的應(yīng)用性考察

2.5.1使用WHO推薦PCR方法對質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增

合成WHO推薦方法中的4套引物探針，以梯度稀釋的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(濃度從106～101copies/μL)為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，根據(jù)不同濃度模板擴(kuò)增的Ct值與濃度之間的關(guān)系，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。擴(kuò)增結(jié)果及建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3，結(jié)果顯示擴(kuò)增成功，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.99，表明質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)pXL12適合應(yīng)用于該方法檢測，可作為實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增H7N9禽流感病毒的陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

2.5.2使用試劑盒方法對質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增

目前商業(yè)化H7N9禽流感病毒檢測試劑盒常采用一步法RT-PCR，對人口咽拭子、鼻拭子以及痰液中H7N9禽流感病毒的H7基因及N9基因的特異性RNA片段進(jìn)行熒光PCR定性檢測。選用上海之江生物科技股份有限公司生產(chǎn)的“人感染H7N9禽流感病毒RNA檢測試劑盒(熒光PCR法)”試劑盒，使用該試劑盒的檢測方法對研制的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)以試劑盒自帶的陽性對照品及H7N9禽流感病毒cDNA為對照。擴(kuò)增結(jié)果見圖4，可以看出，以研制的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為模板時(shí)，H7及N9基因均有陽性擴(kuò)增，與試劑盒自帶的陽性對照品及H7N9禽流感病毒cDNA的擴(kuò)增結(jié)果一致，說明本質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以適用于商業(yè)化試劑盒方法，用于H7N9禽流感病毒的熒光PCR定性檢測。

3 結(jié) 語

本研究中H7N9禽流感病毒檢測質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)包含目前檢測方法中常見的靶標(biāo)基因序列及內(nèi)參基因序列，序列正確，適用于多種檢測方法。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度良好，均勻性、穩(wěn)定性滿足JJG 1006-1994《一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》要求。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為核酸分子，不具有生物危害，可以替代病毒陽性樣本等高危標(biāo)準(zhǔn)品，保障檢測人員的生命安全。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制為H7N9禽流感病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測提供了量值溯源的依據(jù)，為H7N9禽流感病毒檢測實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制提供有力保障。相信通過相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在我國H7N9禽流感病毒檢測實(shí)驗(yàn)室的推廣應(yīng)用，能夠進(jìn)一步提高H7N9禽流感病毒檢測實(shí)驗(yàn)室相關(guān)項(xiàng)目的檢測水平，保障各實(shí)驗(yàn)室測量結(jié)果的可比性、準(zhǔn)確性，為檢驗(yàn)結(jié)果的互認(rèn)和共享打下了良好的基礎(chǔ)。本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制方法也為病毒檢測領(lǐng)域的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)提供一種可行的研制模式，為質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在病毒檢測領(lǐng)域的應(yīng)用研究打下了良好的基礎(chǔ)，對于其他病毒檢測質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制也有參考意義。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1] Tang R B, Chen H L. An overview of the recent outbreaks of the avian-origin influenza A (H7N9) virus in the human.[J]. Journal of the Chinese Medical Association Jcma, 2013, 76(5):245.

[2] 陳執(zhí)中. H7N9禽流感病毒及抗病毒藥物研究進(jìn)展[J]. 食品與藥品, 2013(4):288-291.

[3] 張 寶, 黃克勇, 郭勁松,等. H7N9病毒的來源和重組模式[J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 33(7):1017-1021.

[4] 國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì). 人感染H7N9禽流感診療方案(2013年第2版)[J]. 中華臨床感染病雜志, 2013, 6(2):65-67.

[5] 世界衛(wèi)生組織(WHO). Real-time RT-PCR Protocol for the Detection of Avian Influenza A(H7N9) Virus (Updated on 15 April 2013) [R]. 2013.

[6] 董曉毅, 孫長貴. H7N9禽流感病毒感染及其實(shí)驗(yàn)室診斷[J]. 實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué), 2013, 31(2):105-107.

[7] Wong C K, Zhu H, Li O T,etal. Molecular detection of human H7N9 influenza A virus causing outbreaks in China[J]. Clinical Chemistry, 2013, 59(7):1062-7.

[8] Li Y, Wu T, Qi X,etal. Simultaneous detection of hemagglutinin and neuraminidase genes of novel influenza A (H7N9) by duplex real-time reverse transcription polymerase chain reaction[J]. Journal of Virological Methods, 2013, 194(1-2):194-196.

[9] Spackman E, Senne D A, Myers T J,etal. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes [J]. Journal of Clinical Microbiology, 2002, 40(9):3256.

[10] 羅思思, 謝芝勛, 劉加波,等. H7N9亞型AIV雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測方法的建立[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2013(12):1-5.

[11] 華哲云, 褚 維, 宋黎黎,等. 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR在人感染H7N9禽流感病毒檢測中的應(yīng)用[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué), 2013, 28(9):755-757.

[12] 張嚴(yán)峻, 李 輝, 茅海燕. 禽流感h7n9病毒rt-pcr檢測試劑盒及檢測方法[P]. 中國專利：CN 103276109 A. 2013.

[13] 許 麗, 梁 文, 李 妍,等. 4種阪崎腸桿菌檢測質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制[J]. 實(shí)驗(yàn)室研究與探索, 2016, 35(3):4-8.

[14] JJF 1343-2012， 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理[S].

[15] ISO Guide 35， Reference materials-General and statistical principles for certification [S].

[16] JJG 1006-1994，一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范[S].