鄧波， 江小梨， 劉彬， 張雙偉， 陳利國， 張競之

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院中醫(yī)科，廣東廣州510260；2.暨南大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510632）

高血壓病是一種以動脈血壓升高為特征、臨床上常見的心血管疾病.據(jù)資料顯示，我國心血管疾病死亡率逐年升高，其死亡率居首位，占居民疾病死亡構(gòu)成的40%以上，已經(jīng)高于腫瘤和其他疾病［1］.高血壓病是冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┑闹饕ｋU(xiǎn)因素之一，高血壓患者發(fā)生冠心病是正常血壓人群的3～4倍［2］，因此預(yù)防和控制高血壓有重要臨床意義.血瘀證是高血壓病在中醫(yī)辯證分型中最常見的證型，通過觀察血瘀證患者血清對血管內(nèi)皮功能障礙的影響，可探討高血壓病血瘀證的機(jī)理過程，對防治高血壓引起的冠心病有重要的臨床意義.內(nèi)皮功能障礙是冠心病發(fā)生的重要因素，其主要表現(xiàn)為內(nèi)皮依賴性的舒張功能異常、血管內(nèi)皮黏附功能異常和血管內(nèi)皮炎癥.本研究借鑒陳利國教授提出的血瘀證病證結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型［3］，即采用高血壓血瘀證患者血清處理內(nèi)皮細(xì)胞，觀察高血壓病血瘀證患者血清損傷對內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響，探討高血壓病血瘀證的病理實(shí)質(zhì)和形成機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 主要試劑

EBM-2購自 Lonza公司（貨號：CC-3156），胎牛血清（FBS）購自 BI公司（貨號：04-001-1ACS）；細(xì)胞裂解液（RIPA）購自碧云天公司（貨號：P0013）、一氧化氮（nitric oxide，NO）檢測試劑盒（貨號：A013-2）、內(nèi)皮素（endothelin-1，ET-1）檢測試劑盒（貨號：H093），髓過氧化物酶檢測試盒（貨號：A044）購于南京建成公司；兔抗p-eNOS抗體（貨號：9572）、兔抗 eNOS抗體（貨號：35362）、兔抗 p-腺苷酸活化蛋白激酶 α（adenosine monophosphate activated protein kinaseα，AMPKα）抗體（貨號：2535）、兔抗 AMPKα抗體（貨號：5831）、兔抗甘油醛-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde phosphatedehydrogenase，GAPDH）抗體 （貨號：2118）及兔-IgG二抗（貨號：7074）購自美國 CST公司；兔抗 ICAM-1抗體（貨號：AF6088）、兔抗VCAM-1抗體（貨號：DF6082）購自美國 Affinity公司；Trizol（貨號：15596018）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（貨號：23250）購自 Thermofisher公司；Prime Script RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：RR037A）、SYBR Green qPCR Master Mix熒光定量PCR試劑（貨號：638320）購自Takara公司；引物由Invitrogene公司合成.

1.2 細(xì)胞來源與培養(yǎng)

原代人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）購于 Cell applications公司，采用Lonza的EBM-2內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天換液1次，待細(xì)胞長滿至80%～90%左右單層時(shí)傳代，取第4到6代用于實(shí)驗(yàn).

1.3 病例來源

病例選擇及血清制備相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)按文獻(xiàn)［4-5］.

病例選取2016年3月至2017年6月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院住院確診者.高血壓病診斷符合世界衛(wèi)生組織/國際高血壓學(xué)會統(tǒng)一的“高血壓病”診斷標(biāo)準(zhǔn)，血瘀證診斷參照文獻(xiàn)［6］的診療共識.其中高血壓病血瘀證組：40例，其中2級高血壓32例，3級高血壓8例；男21例，女19例；平均收縮壓（164.25±12.17）mmHg，平均舒張壓（102.73±7.58）mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa）；平均年齡（64.22±7.83）歲.本課題選用的血瘀證主要證型為：陰虛血瘀證、氣虛血瘀證、痰濕血瘀證，其余少量為氣滯血瘀證和熱結(jié)血瘀證，所選病例能較好的代表血瘀證的各種兼證的臨床分布情況.高血壓病非血瘀證組：40例.其中2級高血壓31例，3級高血壓9例；男25例，女15例；平均收縮壓 （166.19±7.56）mmHg，平均舒張壓（103.53±8.47）mmHg；平均年齡（64.60±9.46）歲.兩組患者均為原發(fā)性高血壓患者，排除糖尿病，排除心、腦、腎等靶器官損害及并發(fā)癥，檢查前1周未服用影響血壓的藥物.兩組患者的血壓分級、平均血壓、平均年齡、性別分布、血脂異常無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），具有基線可比性.

1.4 血清采集

試劑患者組及對照組均空腹取血，置入無菌帶帽不抗凝干燥試管，自凝后離心（4℃，2 000 r/min，15 min），取上清液置無菌EP管，凍存于-20℃，備用.

1.5 NO、ET-1含量檢測

將HUVECs接種于24孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別給予體積分?jǐn)?shù)為10%高血壓病血瘀證或非血瘀證患者血清處理24 h，收集細(xì)胞上清，依NO及ET-1檢測試劑盒說明書步驟，檢測NO及ET-1的含量.

1.6 Western blot檢測

將HUVECs接種于6孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別給予高血壓病血瘀證或非血瘀證患者的血清（體積分?jǐn)?shù)均為10%）處理24 h，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗后收集細(xì)胞，加入適量的RIPA裂解液裂解，BCA蛋白定量試劑盒定量，加入上樣緩沖液，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%SDS-PAGE電泳，100 V，90 min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜，1×（TBST）液洗滌3次，每次7 min，加入二抗，37℃孵育 1 h，1×TBST液洗滌 3次，每次 7 min.（Electro-Chemi-Luminescence，ECL）化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，膠片曝光.

1.7 單核細(xì)胞黏附率檢測

HUVECs接種于48孔培養(yǎng)板中，分別給予高血壓病血瘀證或非血瘀證患者血清處理24 h后，PBS洗滌3次，加入新鮮分離的單核細(xì)胞1.00×105個(gè)，37℃ 孵育30 min，無血清培養(yǎng)基輕柔洗滌2次，去除未結(jié)合的粒細(xì)胞.每組4個(gè)復(fù)孔.根據(jù)髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性變化對黏附于內(nèi)皮細(xì)胞上的粒細(xì)胞進(jìn)行定量分析.

粒細(xì)胞黏附率（%）＝黏附單核細(xì)胞MPO活性/總單核細(xì)胞數(shù)（1.00×105個(gè)）MPO活性.

1.8 熒光定量PCR檢測

采用Trizol法提取細(xì)胞的總RNA，按照Prime Script RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，按照SYBR Green qPCR Master Mix熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作.分別以 cDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參，使用定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng).采用primer premier 5.0，根據(jù)腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（NM_000594.3）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1，IL-1β）（NM_000576.2）和 GAPDH（NM_001289745.2）的序列設(shè)計(jì)引物.引物序列為：TNF-α上游：5′-CCA GGG ACC TCT CTC TAA TCA-3′，TNF-α下游：5′-TCA GCT TGA GGG TTTGCT AC-3′；IL-1β上游：5′-ATG GAC AAG CTG AGG AAG ATG-3′；IL-1β下游：5′-CCC ATG TGT CGA AGA AGA TAG G-3′；GAPDH 上游：5′-GGT GTG AAC CAT GAG AAG TAT GA-3′；GAPDH下游 5′-GAG TCC TTC CACGAT ACC AAA G-3′.反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 5 s、60℃ 15 s，72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，最后進(jìn)行熔解曲線的檢測.結(jié)果以Ct值顯示，Ct值為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù).采用相對定量法來比較上述基因表達(dá)的差異.

1.9 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）（±s），多組比較采用單因素方差（One-Way ANOVA），當(dāng)P＜0.05時(shí)，為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 高血壓病血瘀證患者血清對血管內(nèi)皮依賴性舒縮功能的影響

將HUVECs分為兩組，分別給予體積分?jǐn)?shù)為10%高血壓病非血瘀證患者血清（對照組，Control）與體積分?jǐn)?shù)為10%高血壓病血瘀證患者血清（血瘀證組，blood stasis syndrome，BSS），刺激24 h后檢測NO、ET-1以及p-eNOS的表達(dá)，觀察高血壓病血瘀證患者血清對血管內(nèi)皮依賴性舒縮功能的影響.結(jié)果顯示，高血壓病血瘀證患者血清能顯著升高ET-1、降低NO的含量和p-eNOS的表達(dá)，與高血壓病非血瘀證血清比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）.提示高血壓病血瘀證患者血清能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮依賴性舒縮功能異常.

圖1 高血壓病血瘀證患者血清對血管內(nèi)皮依賴性舒縮功能的影響Fig.1 The effects of the serum of on hypertensive patients with blood stasis syndrome on the endothelium dependent relaxation and contraction function

2.2 高血壓病血瘀證患者血清對單核細(xì)胞黏附的影響

采用 Western blot法檢測 ICAM-1、VCAM-1的表達(dá)量、單核細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測單核細(xì)胞黏附率，觀察高血壓病血瘀證患者血清對單核細(xì)胞的影響.結(jié)果顯示：高血壓病血瘀證患者血清能顯著升高黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)，與高血壓病非血瘀證血清相比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）.進(jìn)一步采用單核細(xì)胞黏附模型探索高血壓病血瘀證患者血清對單核細(xì)胞黏附的影響，發(fā)現(xiàn)高血壓病血瘀證患者血清能升高單核細(xì)胞黏附率，與高血壓病非血瘀證血清比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）.提示高血壓病血瘀證患者血清能誘導(dǎo)單核細(xì)胞黏附.

圖2 高血壓病血瘀證患者血清對單核細(xì)胞黏附的影響Fig.2 The effects of the serum of on hypertensive patients with blood stasis syndrome on themonocyte adhesion

2.3 高血壓病血瘀證患者血清對內(nèi)皮炎癥反應(yīng)的影響

采用qPCR法檢測了炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)，以觀察高血壓病血瘀證患者血清對內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的影響.結(jié)果顯示，高血壓病血瘀證患者血清能顯著升高TNF-α和IL-1β的表達(dá)，與高血壓病非血瘀證血清比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）.提示高血壓病血瘀證患者血清能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥.

圖3 高血壓病血瘀證患者血清對內(nèi)皮炎癥反應(yīng)的影響Fig.3 The effects of the serum of on hypertensive patients with blood stasis syndrome on the endothelial inflammation

2.4 高血壓病血瘀證患者血清對內(nèi)皮細(xì)胞AM PK活性的影響

為了探索AMPK在高血壓病血瘀證誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙中的作用，本組進(jìn)一步采用Westernblot法檢測了高血壓病血瘀證患者血清對AMPK激活的影響，發(fā)現(xiàn)高血壓病血瘀證患者血清顯著抑制磷酸化AMPKα的表達(dá)，與高血壓病非血瘀證血清比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）.提示高血壓病血瘀證可能與抑制AMPK有關(guān).

圖4 高血壓病血瘀證患者血清對內(nèi)皮細(xì)胞AMPK活性的影響Fig.4 The effects of the serum of on hypertensive patients with blood stasis syndrome on the activation of AMPK

3 討論

血瘀證是高血壓病中醫(yī)辨證分型中最常見的證型之一，是由多種病理因素所致的“血行失度”、“血脈瘀阻”的病理過程，形成機(jī)理復(fù)雜.“心主血脈”、“脈不通則血不流”、“脈道以通，血?dú)饽诵小钡忍崾酒錂C(jī)理的研究應(yīng)更關(guān)注血管與血瘀證形成的關(guān)系，因此探討“脈”以及“血”與“脈”的關(guān)系成為研究重點(diǎn).血瘀證與血管內(nèi)皮功能具有相關(guān)性［7］，一方面血瘀證能加重血管內(nèi)皮功能障礙，另一方面血管內(nèi)皮功能障礙亦能造成脈道瘀血及“血瘀”的程度，兩者相互促進(jìn)，形成惡性循環(huán).既往研究表明血瘀證者患冠心病的危險(xiǎn)是非血瘀證者的8.959倍［8］.本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，與高血壓非血瘀證相比，高血壓血瘀證血清對內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度更為嚴(yán)重［9-10］.本研究從內(nèi)皮依賴性的舒縮功能異常、血管內(nèi)皮黏附功能異常和血管內(nèi)皮炎癥3個(gè)方面探索高血壓病血瘀證血清對內(nèi)皮功能的影響.研究結(jié)果表明，與高血壓非血瘀證組比較，高血壓病血瘀證患者血清能顯著降低NO含量、eNOS的活性、升高ET-1的含量，這提示高血壓病血瘀證患者血清能引起內(nèi)皮依賴性的舒縮功能異常.本研究結(jié)果顯示高血壓血瘀證患者血清能夠升高黏附因子ICAM-1、VCAM-1的表達(dá)量，明顯提升單核細(xì)胞黏附率，提示高血壓病血瘀證患者血清能誘導(dǎo)單核細(xì)胞黏附.另外，在內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)方面，高血壓血瘀證患者血清能明顯升高炎性因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)水平，提示高血壓血瘀證患者血清能加重內(nèi)皮炎癥反應(yīng)；高血壓病血瘀證患者血清能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮功能障礙.

腺苷酸活化蛋白激酶（adenosinemonophosphate activated protein kinaseα，AMPKα）是參與調(diào)節(jié)生物能量代謝關(guān)鍵分子，各種代謝相關(guān)的組織或細(xì)胞都有所表達(dá)［11］.當(dāng)機(jī)體受到細(xì)胞應(yīng)激、運(yùn)動和多種激素等刺激后，這將會使AMPK活化［12-13］.AMPK具有調(diào)節(jié)eNOS活性以及NO生物合成，維持血管內(nèi)皮的正常功能的作用.在內(nèi)皮細(xì)胞中，活化的AMPK可以磷酸化和激活 eNOS（Ser1177）［14］，這個(gè)位點(diǎn)被激活可以降低 eNOS對 Ca2+的敏感性［15］，同時(shí) eNOS促進(jìn)血管內(nèi)皮分泌 NO［16］，繼而舒張痙攣的血管，改善內(nèi)皮功能，延緩心血管疾病進(jìn)程.AMPK激動劑AICAR不僅能夠抑制TNFα誘導(dǎo)的單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附，還可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子ICAM-1、VCAM-1、E-選擇素（E-selectin）的表達(dá)和分泌，而且上述效應(yīng)可以被AMPK抑制劑 Compound C逆轉(zhuǎn)或緩解［17-18］.同時(shí)有研究表明AMPK活化可以抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［19］.研究表明，臨床上廣泛用于治療糖尿?。?0］、降血壓［21］等藥物通過激活A(yù)MPK發(fā)揮心血管保護(hù)作用.本研究探索AMPK在高血壓病血瘀證患者血清誘導(dǎo)血管內(nèi)皮功能障礙中的作用，結(jié)果提示高血壓病血瘀證患者血清顯著抑制AMPKα的活性.由此，推測高血壓血瘀證患者血清有可能是通過抑制AMPKα的活性，從而抑制內(nèi)皮功能障礙.

本研究明確了高血壓病血瘀證患者血清能誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙，同時(shí)，高血壓病血瘀證患者血清顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞AMPK活性，其誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙作用可能與抑制AMPK有關(guān).AMPK在心血管疾病防治中是一個(gè)重要的潛在靶點(diǎn)，而活血化瘀類中草藥具有心血管保護(hù)的作用或許與激活A(yù)MPK相關(guān).

［1］陳偉偉，劉力生，高潤霖，等.《中國心血管病報(bào)告2016》概要［J］.中國循環(huán)雜志.2017，32（6）：521-530.CHENW W，LIU L S，GAO R L，et al.Summary of《China cardiovascular disease report2016》［J］.Chinese Circulation Journal.2017，32（6）：521-530.

［2］SHRESTH P L， SHRESTHA P A， VIVO R P.Epidemiology of comorbidities in patients with hypertension［J］.Curr Opin Cardiol，2016，31（4）：376-380.

［3］陳利國，胡小勤.論病證結(jié)合血瘀證血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的建立［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，27（3）：267-269.CHEN L G，HU X Q.Discussion on establishment of vascular endothelial cell injury model of blood stasis syndrome based on integration of disease identification and syndrome differentiation［J］.Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine，2007，27（3）：267-269.

［4］張競之，陳利國，賈會欣，等.黃芪多糖對高血壓病血瘀證患者血清損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)、活性的影響［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志.2010，16（16）：170-173.ZHANG J Z，CHEN L G，JIA H X，et al.Effects of astragalus polysaccharide on activity and morphological changes in HUVEC induced by serum from patients with blood stasis syndrome and hypertension［J］.Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，2010，16（16）：170-173.

［5］張競之，陳利國，胡小勤，等.黃芪多糖對原發(fā)性高血壓病血瘀證患Toll樣受體4、核轉(zhuǎn)錄因子-κB表達(dá)的影響［J］.中醫(yī)雜志，2011，52（15）：1286-1289.ZHANG JZ，CHEN L G，HU X Q，et al.Influence of astragalus polysaccharide on the expression of toll-like receptor 4 and nuclear transcription factor-KB in essential hypertension patients with blood stasis［J］.Journal of Traditional Chinese Medicine，2011，52（15）：1286-1289.

［6］杜金行，史載祥.血瘀證中西醫(yī)結(jié)合診療共識［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，31（6）：839-844.DU JX，SHIZ X.Diagnosis and Treatment Guidance for Blood Stasis Syndrome by Integrative Medicine［J］.Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine，2011，31（6）：839-844.

［7］江泳，徐蓉娟，李紅，等.血瘀證與血管內(nèi)皮功能障礙的關(guān)系［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，15（6）：57-59.JIANG Y，XU R J，LI H，et al.The relationship between blood stasis syndrome and vascular endothelial dysfunction［J］. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，2013，15（6）：57-59.

［8］林謙，王曉才，農(nóng)一兵，等.冠心病中醫(yī)證候與冠脈病變程度的相關(guān)性研究［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30（12）：843-845.LIN Q，WANG X C，NONG Y B，et al.Correlation between TCM syndromes of CHD and pathological degree of coronary artery［J］.Journal of Beijing University of Traditional Chinese Medicine，2007，30（12）：843-845.

［9］彭志允，陳利國，賈會欣，等.丹參酮Ⅱ A對高血壓病患者血清損傷后的內(nèi)皮細(xì)胞的影響［J］.中成藥，2012，34（2）：199-203.PENG Z Y，CHEN L G，JIA H X，et al.Effect of tanshinoneⅡA on endothelial cell injured by serum of patients with hypertension［J］.Chinese Traditional Patent Medicine，2012，34（2）：199-203.

［10］張競之，陳小憶，金偉孝，等.丹皮酚對高血壓病血瘀證患者血清損傷的HUVEC-C形態(tài)學(xué)、活性的影響［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，14（6）：29-31.ZHANG JZ，CHEN X Y，JINW X，et al.Effects of pea on activity and changes of HUVEC-C in patients with blood stasis syndrome of hypertension［J］.Journal of Liaoning University of Tcm，2012，14（6）：29-31.

［11］HARDIE D G，ROSS F A，HAWLEY S A.AMPK：a nutrient and energy sensor that maintains energy homeostasis［J］.Nat Rev Mol Cell Bio，2012（13）：251-262.

［12］DAY E A，F(xiàn)ORD R J，STEINBERG G R.AMPK as a therapeutic target for treating metabolic diseases［J］.Trens Endocrinol Metab，2017，8（28）：1-16.

［13］HARDIE D G，SCHAFFER B E，BRUNET A.AMPK：An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs［J］.Trends Cell Biol，2017，3（26）：1-12.

［14］YOUN J，WANG T，CAIH.An Ezrin/Calpain/PI3K/AMPK/eNOSs1179 signaling cascade mediating VEGF-dependent endothelial nitric oxide production［J］.Circ.Res，2009，104（1）：50-59.

［15］MONTAGNANI M，CHEN H，BARR V A，et al.Insulin-stimulated activation of eNOS is independent of Ca2+but requires phosphorylation by Akt at Ser1179［J］.JBiol Chem，2001，276（32）：30392-30398.

［16］De CATERINA R，LIBBY P，PENG H B，et al.Nitric oxide decreases cytokine-induced endothelial activation.Nitric oxide selectively reduces endothelial expression of adhesion molecules and proinflammatory cytokines［J］.J Clin Invest，1995，96（1）：60-68.

［17］ZHANG Y，QIU J，WANG X，et al.AMP-activated protein kinase suppresses endothelial cell inflammation through phosphorylation of transcriptional coactivator p300［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2011，31（12）：2897-2907.

［18］JUNG C H，LEE M J，KANG Y M，et al.Vaspin inhibits cytokine-induced nuclear factor-kappa B activation and adhesion molecule expression via AMP-activated protein kinase activation in vascular endothelial cells［J］.Cardiovasc Diabetol，2014，41（13）：1-12.

［19］LI P，LI X，WU Y，et al.A novel AMPK activator hernandezine inhibits LPS-induced TNFαproduction［J］.oncotarget，2017，8（40）：67218-67226.

［20］NESTIL，NATALIA.Metformin effects on the heart and the cardiovascular system：A review of experimental and clinical data［J］.Nutr Metab Cardiovasc Dis，2017，27（8）：657-669.

［21］SUNG J Y，CHOI H C.Nifedipine inhibits vascular smooth muscle cell proliferation and reactive oxygen species production through AMP-activated protein kinase signaling pathway［J］.Vascul Pharmacol，2012，56（1-2）：1-8.