程倩， 楊建昆， 杜曉媛

（1.錦州醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 病理學(xué)教研室，遼寧錦州121000；2.南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東廣州510630）

坍陷反應(yīng)介導(dǎo)蛋白（collapsing response mediator proteins，CRMPs）又稱 TUC（TOAD-64、Ulip、DRP），是大腦發(fā)育過(guò)程中高度表達(dá)的胞質(zhì)磷酸蛋白，最初是在Sema3信號(hào)研究和神經(jīng)分化研究中發(fā)現(xiàn)的［1-4］.近來(lái)，越來(lái)越多的研究顯示，CRMPs與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展以及疾病預(yù)后密切相關(guān).CRMP2作為CRMPs家族成員中的重要成員，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其具有多種細(xì)胞生物學(xué)功能.前期研究已證實(shí)CRMP2在結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌中均高表達(dá)，提示CRMP2可能是腫瘤發(fā)生進(jìn)展的重要基因.因此，本研究檢測(cè)CRMP2在非肌層浸潤(rùn)性膀胱尿路上皮癌中（Non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC）的表達(dá)水平，分析其與臨床病理特征的相關(guān)性，探討其在腫瘤復(fù)發(fā)、進(jìn)展及生存時(shí)間中的預(yù)測(cè)價(jià)值，為膀胱尿路上皮癌預(yù)后評(píng)估提供新的判斷依據(jù)，并為膀胱癌個(gè)性化治療提供新的可能的治療靶標(biāo)，具有十分重要的臨床意義.

1 研究對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性收集2005年5月至2009年5月遼寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及遼河油田總醫(yī)院130例非肌層浸潤(rùn)性膀胱尿路上皮癌（NMIBC）石蠟包埋標(biāo)本切片，所有患者均病理確診為無(wú)轉(zhuǎn)移的NMIBC.排除標(biāo)準(zhǔn)包括：（1）臨床或病理資料不全；（2）合并其他部位腫瘤或者其他成分腫瘤（腺癌、鱗癌、肉瘤）；（3）隨訪資料缺失（病人在2年內(nèi)失訪）.平均年齡68.5歲（47～81歲），男 71例，女 59例，Ta期67例，T1期63例.15例膀胱鏡檢取材正常膀胱黏膜作為對(duì)照，平均年齡67歲（63～75歲），男8例，女7例.本研究申請(qǐng)了參與單位倫理審查委員會(huì)的審核并獲得了實(shí)驗(yàn)批準(zhǔn).所有受試人員在試驗(yàn)前均已知情研究?jī)?nèi)容，并簽署了相關(guān)知情同意書.

1.2 主要試劑及儀器

免疫組化試劑盒（凱基KGOS60），二甲苯、無(wú)水乙醇、檸檬酸鈉、雙氧水、蘇木素、PBS粉、Triton-100，包埋機(jī)，切片機(jī)（美國(guó)Therom公司），烘干機(jī)，倒置顯微鏡（日本Olympus公司），Milli-Q純水器（Millipore）.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)技術(shù)

將切片置于烤箱中55℃1 h.3缸二甲苯，每缸各浸泡5min脫蠟.梯度酒精（體積分?jǐn)?shù)分別為100%、95%、80%、75%）水化.體積分?jǐn)?shù)為3%的H2O2中微波低火3 min去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶.去離子水 I、去離子水 II各 1 min.濃度為 10 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液（PH 6.0）高壓鍋抗原修復(fù)，在修復(fù)液中自然冷卻.去離子水I、去離子水Ⅱ各1 min.3缸PBST（PBS 200 mL+體積分?jǐn)?shù)4%Triton 250μL）潤(rùn)洗，各 5 min.玻片甩干，擦片，免疫組化筆畫圈，范圍可稍大避免邊緣效應(yīng).在濕盒上平鋪玻片，滴加一抗兔抗人CRMP2抗體（體積比為1∶200，abcam，ab129082），4℃冷庫(kù)孵育過(guò)夜.取出玻片，3缸PBST浸洗，每次5 min.甩干，擦干背側(cè)及圈外水分，滴加二抗，37℃溫箱中30 min.DAB顯色，蘇木素復(fù)染.梯度酒精體積分?jǐn)?shù)分別為75%、80%、95%、100%）各3～5 min進(jìn)行脫水.二甲苯透明后中性樹膠封片.風(fēng)干2～3 d.

1.3.2 染色強(qiáng)度評(píng)判

在不知道任何臨床資料和病理資料的情況下，對(duì)免疫組化切片進(jìn)行評(píng)估，本研究入選的所有患者病理玻片均由遼寧醫(yī)學(xué)院病理教研室資深醫(yī)師在相同條件下觀察每張切片后對(duì)結(jié)果作出判斷.陽(yáng)性染色程度分為4級(jí)：無(wú)染色為0分（-），淡黃色定為1分（+），棕黃色評(píng)為2分（++），棕褐色則為3分（+++）.陽(yáng)性細(xì)胞百分率的判斷：每張切片隨機(jī)地至少選取4個(gè)不同高倍鏡下取視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)至少100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評(píng)分：0分，0%；1分，1%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，76%～100%［5］.每個(gè)樣本的最終綜合評(píng)分為染色強(qiáng)度評(píng)分與陽(yáng)性細(xì)胞百分比之積，結(jié)果判定：0分為陰性，1～2分表示弱陽(yáng)性（+），3～8分提示中度陽(yáng)性（++），9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）.本研究以綜合評(píng)分≥4分為陽(yáng)性，＜4分為陰性.

1.4 隨訪方案

遵中華泌尿外科學(xué)會(huì)膀胱癌診療指南，所有病例在TURBT術(shù)后兩年內(nèi)每3個(gè)月行膀胱鏡檢查1次，3～5年每6個(gè)月行膀胱鏡檢查1次，此后每年1次.復(fù)發(fā)定義為膀胱鏡檢查或者影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)膀胱內(nèi)菜花狀結(jié)節(jié)，或者可疑黏膜活檢證實(shí)為膀胱癌.進(jìn)展定期為復(fù)發(fā)后再次手術(shù)的病理出現(xiàn)分級(jí)或者分期進(jìn)展，影像學(xué)發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移.

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 16.0軟件.本研究主要觀察終點(diǎn)為復(fù)發(fā)和進(jìn)展.用K-M生存曲線分析各因素對(duì)NMIBC術(shù)后復(fù)發(fā)率和進(jìn)展率的影響，Log-rank比較組間差異.Cox回歸分析探討觀NMIBC復(fù)發(fā)和進(jìn)展的獨(dú)立影響因素.P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2 結(jié)果

2.1 病人基本資料特征與CRMP2關(guān)系

130例患者的臨床病理信息詳見(jiàn)表1.經(jīng)免疫組化分析，按照課題組既定的陽(yáng)性及陰性診斷標(biāo)準(zhǔn)（半定量評(píng)估方法），經(jīng)兩個(gè)病理學(xué)專家分析，結(jié)果顯示CRMP2免疫組化染色主要定位是在細(xì)胞漿，亦有少許細(xì)胞核存在陽(yáng)性表達(dá)（圖1）.經(jīng)統(tǒng)計(jì)CRMP2低度陽(yáng)性表達(dá)患者共計(jì)70例，高度陽(yáng)性表達(dá)共計(jì)60例.結(jié)果發(fā)現(xiàn)癌組織中CRMP2表達(dá)水平與患者的年齡、性別、手術(shù)方式以及腫瘤大小無(wú)明顯的相關(guān)性.而CRMP2表達(dá)水平在腫瘤分級(jí)較高的膀胱尿路上皮癌組織顯著高于腫瘤分級(jí)較低的膀胱尿路上皮癌組織標(biāo)本（P＝0.009）.此外，復(fù)發(fā)性非肌層浸潤(rùn)性膀胱尿路上皮癌組織中CRMP2表達(dá)水平要顯著高于無(wú)復(fù)發(fā)的非肌層浸潤(rùn)性膀胱尿路上皮癌組織（P＜0.01）.術(shù)后發(fā)生腫瘤進(jìn)展的非肌層浸潤(rùn)性膀胱尿路上皮癌組織中CRMP2的表達(dá)水平顯著地高于術(shù)后沒(méi)有發(fā)生進(jìn)展的非肌層浸潤(rùn)性膀胱尿路上皮癌（P＜0.01）.

表1 130例膀胱尿路上皮癌患者臨床病理特征與CRMP2表達(dá)水平相關(guān)性Table 1 The clinicopathological features of 130 cases of bladder urothelial carcinoma and the relationships of CRMP2 expression level n（%）

圖1 CRMP2在正常膀胱粘膜和膀胱癌組織表達(dá)免疫組化染色（IHC）代表圖Fig.1 Immunohistochemical staining（IHC）expression level of CRMP2 in normal bladdermucosa and bladder cancer tissue

2.2 CRMP2表達(dá)水平與膀胱尿路上皮癌預(yù)后相關(guān)性

通過(guò)36～100個(gè)月的隨訪；在隨訪期內(nèi)發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)的有53例（40.8%），發(fā)生腫瘤進(jìn)展的有21例（16.2%）；其中14例在隨訪期內(nèi)死亡（10.7%）.生存分析結(jié)果顯示CRMP2高表達(dá)的膀胱尿路上皮癌患者復(fù)發(fā)率明顯高于CRMP2低表達(dá)的患者（P＜0.001，圖 2A）.而 CRMP2高表達(dá)患者的腫瘤進(jìn)展率明顯高于CRMP2低表達(dá)患者（P＝0.038，圖2B）.CRMP2高表達(dá)患者腫瘤總體生存率明顯低于CRMP2低表達(dá)患者（P＝0.024，圖2C）.

圖2 CRMP2表達(dá)水平與膀胱尿路上皮癌預(yù)后的相關(guān)性的生存分析Fig.2 Survival analysis of the correlation between CRMP2 expression level and the prognosis of bladder urothelial carcinoma

2.3 CRMP2是膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)和進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素

為探討CRMP2是否是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，課題組將觀察終點(diǎn)設(shè)定為腫瘤復(fù)發(fā)和進(jìn)展.為進(jìn)一步探討CRMP2表達(dá)水平是否是膀胱尿路上皮癌術(shù)后復(fù)發(fā)和進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素.首先將患者年齡、性別、手術(shù)方式、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、腫瘤分級(jí)、原發(fā)腫瘤病理分期和CRMP2表達(dá)水平納入單因素分析，將單因素分析結(jié)果中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量納入多因素模型分析中.對(duì)于膀胱尿路上皮癌術(shù)后復(fù)發(fā)這一觀察終點(diǎn)，單因素分析結(jié)果顯示腫瘤分級(jí)、腫瘤數(shù)目及CRMP2表達(dá)水平與非肌層浸潤(rùn)性膀胱尿路上皮癌術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān).進(jìn)一步用Cox回歸多因素分析顯示腫瘤分級(jí)、腫瘤數(shù)目及CRMP2表達(dá)水平是非肌層浸潤(rùn)性膀胱尿路上皮癌術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（表2）.對(duì)于腫瘤進(jìn)展這一觀察終點(diǎn)，單因素分析顯示原發(fā)腫瘤病理分期、腫瘤數(shù)目、腫瘤分級(jí)及CRMP2表達(dá)水平與膀胱尿路上皮癌術(shù)后發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān).進(jìn)一步多因素分析顯示腫瘤分級(jí)、腫瘤分期和CRMP2表達(dá)水平是非肌層浸潤(rùn)性膀胱尿路上皮癌術(shù)后腫瘤進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（表3）.

表2 膀胱尿路上皮癌術(shù)后首次復(fù)發(fā)獨(dú)立危險(xiǎn)因素單因素及多因素分析Table 2 Univariate and multivariate factors of independent risk factors for the first recurrence of bladder urothelial carcinoma after operation

表3 膀胱尿路上皮癌術(shù)后進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素單因素分析及多因素模型Table 3 Univariate and mu ltivariate factors of independent risk factors for the first p rogression of bladder urothelial carcinoma after operation

3 討論

膀胱尿路上皮癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤.隨著現(xiàn)代腫瘤生物學(xué)研究的迅速進(jìn)展，很多與膀胱尿路上皮癌相關(guān)的腫瘤生物分子標(biāo)志物被研究和證實(shí)，初步揭示其在膀胱尿路上皮癌的早期診斷、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、復(fù)發(fā)進(jìn)展以及死亡中的重要作用.有些生物分子還被證實(shí)了潛在的治療靶標(biāo)，但這些膀胱尿路上皮癌標(biāo)志物均存在敏感性和特異性低的問(wèn)題，難以切實(shí)應(yīng)用到膀胱尿路上皮癌臨床診斷、預(yù)后及治療中.

CRMPs是在Sema3信號(hào)研究和神經(jīng)分化研究中發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)高度表達(dá)的胞質(zhì)磷酸蛋白，該家族存在5個(gè)成員（CRMP1～CRMP5），具有很高的序列同源性，對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)和分化起重要作用.近年來(lái)，越來(lái)越多的研究報(bào)道CRMPs在人類腫瘤組織中差異性表達(dá)，并與臨床病理特征及患者預(yù)后密切相關(guān).CRMP1在肺癌組織中比癌旁正常組織明顯低表達(dá)，CRMP1低表達(dá)提示疾病預(yù)后差，疾病進(jìn)展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，術(shù)后早期復(fù)發(fā)、生存時(shí)間短［5-7］.CRMP1的新異構(gòu)體 LCRMP1表達(dá)也與非小細(xì)胞肺癌患者的臨床結(jié)局和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān).LCRMP1和CRMP1在調(diào)節(jié)癌癥細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中具有相反的功能［6，8-9］.CRMP2與結(jié)直腸癌和乳腺癌進(jìn)展相關(guān)［10-11］.與其他正常組織比較，CRMP2在結(jié)直腸正常組織或癌組織中高表達(dá).結(jié)直腸癌標(biāo)本中 CRMP2陽(yáng)性率達(dá) 58.6%（99/169），與早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和5年生存率無(wú)明顯關(guān)系［10］.在乳腺癌中，CRMP2無(wú)論在mRNA還是蛋白水平均明顯下調(diào).而且，磷酸化CRMP2核內(nèi)表達(dá)水平與組織惡性度和三陰乳腺癌成比例［11］.CRMP3則定位于10號(hào)染色體 q25.2-q26［12］，多種腫瘤抑癌基因也定位于附近區(qū)域［13-14］.此外，80%的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤在該染色體區(qū)域存在突變.CRMP3與惡性腫瘤的副癌神經(jīng)綜合征相關(guān)［12］.CRMP4在轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織中差異性表達(dá)下調(diào)，提示CRMP4是前列腺癌轉(zhuǎn)移的抑制基因.通過(guò)對(duì)CRMP4啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，CRMP4啟動(dòng)子甲基化是導(dǎo)致基因表達(dá)沉默，引起前列腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制［15-16］.與此相反，Hiroshima等［17］對(duì)胰腺癌研究報(bào)道，CRMP4在胰腺癌中高表達(dá)并與靜脈侵犯和肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，CRMP4是胰腺癌術(shù)后生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，是胰腺癌促癌基因.CRMP5被認(rèn)為與副癌綜合征密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)98.6%的高級(jí)別神經(jīng)內(nèi)分泌肺癌（小細(xì)胞肺癌和大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌肺癌）標(biāo)本中CRMP5廣泛高表達(dá)［18］.成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤CRMP5高表達(dá)患者術(shù)后生存時(shí)間還不及CRMP5低表達(dá)患者的一半［19］.本研究首次發(fā)現(xiàn)CRMP2表達(dá)水平在膀胱尿路上皮癌組織中明顯比正常組織高表達(dá).通過(guò)將CRMP2表達(dá)水平與臨床病理特征進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，CRMP2高表達(dá)與膀胱尿路上皮癌分級(jí)、分期、進(jìn)展呈正性相關(guān)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，提示CRMP2在膀胱尿路上皮癌發(fā)生、進(jìn)展中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用.

CRMP2在膀胱尿路上皮癌組織中高表達(dá)，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步探討.有報(bào)道，CRMP2結(jié)合Tubulin異源聚合物能夠促進(jìn)微管組裝，促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)，而CRMP2缺失能夠促進(jìn)非神經(jīng)細(xì)胞死亡，提示CRMP2調(diào)控神經(jīng)元以及非神經(jīng)細(xì)胞的增殖［21-23］.Lin等［24］報(bào)道 CRMP2屬于微管相關(guān)蛋白質(zhì)，其碳端490-572aa介導(dǎo)微管結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂，且這一過(guò)程能夠被紫杉醇所抑制，提示膀胱尿路上皮癌中CRMP2過(guò)表達(dá)可能促進(jìn)膀胱尿路上皮癌細(xì)胞加速細(xì)胞分裂和增殖，靶向抑制CRMP2有可能抑制腫瘤細(xì)胞的分裂增殖.CRMP2還是P53的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，抑制抑癌基因P53表達(dá)，提示 CRMP2發(fā)揮促癌作用［25］.Martins等［26］通過(guò)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，CRMP2與Rho信號(hào)通路的多個(gè)蛋白直接結(jié)合，而Rho信號(hào)通路參與細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞增殖等細(xì)胞重要活動(dòng)，提示CRMP2參與調(diào)控細(xì)胞骨架、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)以及細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和增殖.CRMP2還與細(xì)胞分裂相關(guān)蛋白直接作用，再次提供證據(jù)提示CRMP2促進(jìn)細(xì)胞增殖的可能.此外，CRMP2還與細(xì)胞能量代謝蛋白如SPR、PDHX直接結(jié)合，能量代謝增強(qiáng)是腫瘤惡性增殖的重要環(huán)節(jié)，因此，CRMP2可能通過(guò)促進(jìn)能量代謝，進(jìn)而促進(jìn)膀胱尿路上皮癌的惡性生物學(xué)行為［26］.綜上所述，CRMP2在膀胱尿路上皮癌中高表達(dá)促進(jìn)膀胱尿路上皮癌惡性生物行為的可能機(jī)制有：①作為微管相關(guān)蛋白促進(jìn)微管組裝，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖；②參與調(diào)控P53、Rho等腫瘤相關(guān)信號(hào)通路，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的骨架動(dòng)力學(xué)，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞增殖，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力；③增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞能量代謝，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖.

雖然本研究未能明確CRMP2促進(jìn)膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制，但闡明了CRMP2在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)情況，提示CRMP2作為判定膀胱尿路上皮癌預(yù)后及個(gè)性化治療的靶點(diǎn)的潛在價(jià)值.

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