武愛榮(西安高新醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安 710075)

B族鏈球菌(group Bstreptococcus，GBS)亦稱無(wú)乳鏈球菌，是一種β溶血的革蘭陽(yáng)性鏈球菌，GBS是人類泌尿生殖道和胃腸道的定植菌，一般孕婦的定植率為10%～30%[1]，且定植率隨年齡、人種、地域的不同而不同，據(jù)報(bào)道，我國(guó)孕婦定植率為5%～15%[2]。GBS可引起圍產(chǎn)期孕婦嚴(yán)重感染，導(dǎo)致胎膜早破、早產(chǎn)、新生兒的宮腔感染和敗血癥等，嚴(yán)重時(shí)危及生命。而真菌作為圍產(chǎn)期孕婦的另一種條件致病菌，也會(huì)導(dǎo)致胎膜早破和早產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局。所以，檢測(cè)孕晚期孕婦生殖道GBS和真菌的定植狀況，采取有效的預(yù)防和治療措施是非常有必要的。本文采用血瓊脂培養(yǎng)法、顯色培養(yǎng)法及PCR法三種方法，分別進(jìn)行GBS和真菌篩查，并對(duì)GBS藥物敏感性進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇我院2013年1月～2017年12月產(chǎn)科門診就診孕婦22 938例，孕齡35～37周，孕婦年齡21～40歲，平均年齡27.6歲，由接診醫(yī)生按規(guī)范采集孕婦陰道和肛周拭子，患者或家屬立即送檢。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 GBS培養(yǎng)鑒定：VITEK2 Compact細(xì)菌鑒定儀、GP鑒定卡、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基、B族鏈球菌篩查培養(yǎng)基均為梅里埃公司產(chǎn)品。

1.2.2 GBS的藥敏定量試驗(yàn)：應(yīng)用梅里埃VITEK2 Compact鑒定儀、GP67藥敏卡，質(zhì)控菌株：無(wú)乳鏈球菌ATCC12386和金黃色葡萄球菌ATCC25923，均購(gòu)自中國(guó)衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.2.3 PCR檢測(cè)：試劑選用泰普生物有限公司生產(chǎn)的GBS核酸檢測(cè)試劑盒，GBS核酸檢測(cè)陰、陽(yáng)性對(duì)照品，均由試劑盒廠家提供；儀器為上海宏石SLAN-48P熒光定量PCR擴(kuò)增儀。

1.2.4 真菌篩查：哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基、B族鏈球菌篩查培養(yǎng)基及念珠菌顯色培養(yǎng)基均為梅里埃公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集：對(duì)孕35～37周的孕婦，參照2002年CDC推薦的方法，進(jìn)行規(guī)范取材。準(zhǔn)備兩根無(wú)菌女性拭子，拿一根棉拭子放入陰道內(nèi)1/3處，采取陰道分泌物，取材時(shí)不需要使用陰道窺器；另一根棉拭子插入肛門至肛門括約肌上2～3 cm處，取直腸分泌物。

1.3.2 GBS篩查方法

1.3.2.1 血瓊脂培養(yǎng)法：將采集的拭子立即送到實(shí)驗(yàn)室，接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，放于35℃5 ml/dl CO2培養(yǎng)箱孵育18～36 h，挑取β溶血灰白小菌落，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢為陽(yáng)性球菌，觸酶試驗(yàn)(-)，分純并做CAMP試驗(yàn)：即將待測(cè)菌株與金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC25923)，在羊血培養(yǎng)基上成90°角垂直劃線，放于37℃培養(yǎng)箱孵育過(guò)夜，如果在金黃色葡萄球菌的β-溶血素與CAMP因子擴(kuò)散區(qū)域出現(xiàn)三角形增強(qiáng)β-溶血區(qū)，則該試驗(yàn)為陽(yáng)性；待次日CAMP試驗(yàn)(+)，用VITEK2 Compact進(jìn)行鑒定及藥敏試驗(yàn)。

1.3.2.2 顯色培養(yǎng)法：將采集的拭子盡快運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，直接接種于顯色培養(yǎng)基，放于37℃培養(yǎng)箱孵育18～36 h，挑取紅色菌落，做CAMP試驗(yàn)，并分純培養(yǎng)；待次日CAMP試驗(yàn)(+)，用VITEK2 Compact系統(tǒng)進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)。

1.3.2.3 熒光PCR法：將采集的陰、肛拭子作為一組標(biāo)本，嚴(yán)格按照GBS核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書要求進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果判定。

1.3.3 真菌篩查：將血瓊基培養(yǎng)基上灰白衛(wèi)星樣小菌落或灰白小菌落、B族鏈球菌篩查培養(yǎng)基上呈淺綠色小菌落或灰白小菌落，進(jìn)行涂片和革蘭氏染色，當(dāng)鏡檢為真菌孢子時(shí)，再接種于念珠菌顯色培養(yǎng)基，參照其產(chǎn)品說(shuō)明書，判斷顯色結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用陽(yáng)性率表示，組間差異比較采用多個(gè)樣本率的χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 三種方法檢測(cè)GBS的結(jié)果比較 見表1。顯色培養(yǎng)法篩查GBS陽(yáng)性率明顯高于PCR法和血瓊脂培養(yǎng)法，該顯色方法檢出的263株呈紅色菌落，CAMP篩查試驗(yàn)陽(yáng)性261株，陽(yáng)性率為99.2%(261/263)，263株經(jīng)VITEK2 Compact鑒定儀進(jìn)行菌種鑒定，全部為GBS。三種方法檢測(cè)GBS比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=94.05，P<0.05)。雖然某些豕鏈球菌在該顯色培養(yǎng)基上也呈現(xiàn)與GBS相同的顏色，但在本研究中還未遇到。

表1 血瓊脂培養(yǎng)法、顯色培養(yǎng)法和PCR法檢測(cè)結(jié)果比較

2.2 兩種培養(yǎng)方法檢測(cè)真菌的結(jié)果比較 22 938例孕婦標(biāo)本中，6 782例采用血瓊脂培養(yǎng)，檢出真菌665例(陽(yáng)性率9.8%)；5 957例采用顯色培養(yǎng)基直接培養(yǎng)，檢出真菌72例(陽(yáng)性率1.2%)，兩種培養(yǎng)方法對(duì)真菌的檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=429.99，P<0.05)。

2.3 培養(yǎng)法分離出的368例GBS的耐藥性分析 對(duì)培養(yǎng)法分離出的368例GBS進(jìn)行藥物敏感的MIC值檢測(cè)，結(jié)果見表2。

表2 培養(yǎng)分離出的368例GBS的耐藥性分析(n=368)

3討論

3.1 自20世紀(jì)70年代以來(lái)，有報(bào)道稱GBS是侵入性新生兒感染的致病菌，而導(dǎo)致侵入性新生兒感染最重要的危險(xiǎn)因素是產(chǎn)婦泌尿生殖道或胃腸道定植的GBS。1996年，美國(guó)疾病預(yù)防控制中心發(fā)布了用于預(yù)防新生兒GBS感染的推薦方案，隨后，分別在2002年與2010年進(jìn)行了修訂。這些指南的實(shí)施，大幅度減少了早發(fā)型新生兒GBS感染[1]。但由于很多醫(yī)院在篩查方法上并沒(méi)有按照美國(guó)推薦的方法統(tǒng)一執(zhí)行，而且GBS定植率隨人種、地域、年齡不同而不同，檢出率差異很大。國(guó)內(nèi)有報(bào)道妊娠婦女 GBS帶菌率為3.5%～32.4%[3]，如廈門地區(qū)的14.43%[4]，山東地區(qū)的32.2%[5]，北京地區(qū)的7.3[6]%，本研究結(jié)果顯示西安地區(qū)妊娠婦女GBS帶菌率較低(4.4%)，其中血瓊脂培養(yǎng)法和PCR法的陽(yáng)性率分別為1.5%和2.8%，明顯低于顯色培養(yǎng)法(4.4%)，這可能與取材、工作人員對(duì)該菌的認(rèn)識(shí)、實(shí)驗(yàn)操作等有關(guān)。雖然PCR法用時(shí)短，但對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求高、成本高、不易普及，也無(wú)法給臨床提供藥敏結(jié)果。而顯色培養(yǎng)基是一種含有3種顯色底物和抗生素的選擇性培養(yǎng)基，標(biāo)本直接接種，GBS經(jīng)18～24 h呈典型紅色菌落，即可分純鑒定，該方法檢出率高、無(wú)需增菌、方便操作，培養(yǎng)出的GBS經(jīng)分純后可進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求不高，有微生物實(shí)驗(yàn)室的醫(yī)院均能開展。因此，顯色培養(yǎng)法有望成為妊娠晚期孕婦常規(guī)篩查GBS定植的一種準(zhǔn)確快速的方法。

3.2 健康婦女泌尿生殖道定植多種微生物，與宿主之間保持微生態(tài)平衡。而妊娠期婦女受激素水平的影響，陰道黏膜充血和通透性增加，容易發(fā)生感染，有研究表明感染是被公認(rèn)的重要發(fā)病原因[7]。假絲酵母菌為陰道內(nèi)條件致病菌，能夠穿透絨毛膜并侵犯胎兒，導(dǎo)致胎膜早破和早產(chǎn)。楊淑華等[8]報(bào)道131例胎膜早破患者中，真菌占生殖道分泌物致病菌的51.1%。雖然國(guó)內(nèi)張利俠等[9]報(bào)道真菌對(duì)引起胎膜早破并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)論，這可能與所選人群有關(guān)，畢竟引起胎膜早破并不僅僅是這一種感染因素導(dǎo)致的。楊生宇等[10]報(bào)道孕晚期篩查真菌對(duì)預(yù)防胎膜早破、新生兒感染等不良妊娠結(jié)局具有非常重要的意義。本研究選用的兩種培養(yǎng)法對(duì)真菌有一定的檢出優(yōu)勢(shì)，尤其是血瓊脂培養(yǎng)陽(yáng)性率為9.8%，低于李馨等[11]報(bào)道的15.74%。通過(guò)本次研究，雖然顯色培養(yǎng)法對(duì)真菌檢出率較低，但如果將兩種方法聯(lián)合使用，同時(shí)提高實(shí)驗(yàn)室人員對(duì)真菌的重視和認(rèn)識(shí)，在提高真菌檢出率的同時(shí)，可將GBS一并檢出，做到早發(fā)現(xiàn)、早治療。

3.3 參照美國(guó)疾病預(yù)防控制中心(CDC)推薦，把青霉素G和氨芐青霉素作為妊娠晚期GBS的預(yù)防性用藥，對(duì)青霉素過(guò)敏的孕婦，可使用紅霉素或克林霉素[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)368株GBS，對(duì)青霉素、氨芐西林、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢吡肟、利奈唑胺和萬(wàn)古霉素的敏感率均為100%；對(duì)紅霉素、克林霉素和左氧氟沙星的敏感率分別為17.9%，25.4%和66.7%。與國(guó)內(nèi)相關(guān)的研究敏感率一致[5，13]。隨著細(xì)菌耐藥性的改變，尤其是GBS對(duì)紅霉素類和克林霉素類藥物耐藥性的不斷升高，臨床在治療GBS感染的患者時(shí)，應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果選擇用藥。有研究表明[14]，妊娠晚期給予抗生素治療，不僅可有效減少胎膜早破、早產(chǎn)和新生兒敗血癥等，還可以提高陰道分娩率，降低剖腹產(chǎn)比例。我院自2013年至今，有一例新生兒是由GBS引起血流感染，但經(jīng)查詢?cè)摶純菏菑耐庠恨D(zhuǎn)來(lái)的，其母親在我院無(wú)產(chǎn)檢記錄，說(shuō)明檢測(cè)孕婦GBS感染狀況，及時(shí)采取治療措施，對(duì)預(yù)防胎膜早破、新生兒感染等不良妊娠結(jié)局有重要的臨床價(jià)值。

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