高張晉，王方坤，尹 潔，王 麗，楊雄斌，楊小琴，郭利軍*

（1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理 671000；2.大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

L型菌是一類細(xì)胞壁缺失或缺陷的細(xì)菌變異株，因1935年在Lister研究院首次被發(fā)現(xiàn)而得名，目前在大多數(shù)細(xì)菌、螺旋體和真菌中都發(fā)現(xiàn)L型的存在，L型菌的形成與長期大量使用抗菌藥物有關(guān)〔1〕。一般認(rèn)為破壞細(xì)菌細(xì)胞壁合成的抗菌藥物可誘導(dǎo)細(xì)菌轉(zhuǎn)變?yōu)長型，但有研究表明，喹諾酮類抗菌藥物左氧氟沙星也能誘導(dǎo)出大腸埃希菌和痢疾志賀菌的L型，而喹諾酮類是抑制細(xì)菌DNA螺旋酶的抗菌藥物〔2〕，說明不只作用于細(xì)胞壁的抗菌藥物能導(dǎo)致L型菌的產(chǎn)生。目前常用抗真菌藥物唑類、多烯類和核苷類都不是作用于真菌細(xì)胞壁產(chǎn)生殺菌或抑菌作用。有學(xué)者報(bào)道，曾從患病者體液中分離出念珠菌的L型，用兩性霉素B、酮康唑、氟康唑等抗真菌藥物可誘導(dǎo)念珠菌和隱球菌細(xì)胞壁缺損而形成L型菌〔3-11〕。但國內(nèi)對真菌L型的報(bào)道較少，迄今為止尚無對誘導(dǎo)真菌L型形成的藥物劑量、作用時(shí)間的研究，L型真菌的形態(tài)改變亦不明確。為此我們擬采用氟康唑、兩性霉素B、氟胞嘧啶作為誘導(dǎo)劑，以期在實(shí)驗(yàn)條件下誘導(dǎo)出白假絲酵母菌L型，探討抗真菌藥物在白假絲酵母菌L型形成過程中可能的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 白假絲酵母菌TCC10231，由大理大學(xué)病原生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 藥物 氟康唑（fluconazole，F(xiàn)CZ）、氟胞嘧啶（fluorocytosine，5-FC）和可溶性兩性霉素B（ampho?tericin B，AmB）均購自北京索萊寶科技有限公司，批號分別為20151127、20160509、319A0529。氟胞嘧啶和可溶性兩性霉素B用雙蒸水溶解，氟康唑用二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF）溶解，儲(chǔ)存液均配成1 280 μg∕mL，過濾除菌，分裝于1.5 mL小離心管，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 培養(yǎng)基 高滲液體培養(yǎng)基按文獻(xiàn)〔12〕中方法稍加改進(jìn)：含0.25%NaCl、0.5%葡萄糖、0.1%硫乙醇酸鈉、1%蛋白胨、0.5%酵母粉、0.5%牛肉浸膏、0.05%L-胱氨酸、20%蔗糖、10%豬血漿。高滲固體培養(yǎng)基：在上述基礎(chǔ)上加1%瓊脂。沙保氏瓊脂培養(yǎng)基（杭州天和微生物試劑有限公司，批號140110）。上述培養(yǎng)基分別用蒸餾水溶解后，進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，固體培養(yǎng)基制成平板，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 細(xì)胞壁染色液 按文獻(xiàn)〔12〕中改良方法配制：10%鞣酸水溶液，5%結(jié)晶紫水溶液，5%剛果紅水溶液。

1.2 誘導(dǎo)方法 參照美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（National Committee for Clinical Laboratory Standard，NCCLS）推薦的酵母菌液基稀釋法真菌藥敏試驗(yàn)參考方案〔13〕，在此基礎(chǔ)上將RPMI-1640培養(yǎng)基替換為高滲液體培養(yǎng)基，并按一定方案添加抗真菌藥物，具體如下。

1.2.1 藥物稀釋 采用對倍稀釋法用高滲液體培養(yǎng)基稀釋藥物儲(chǔ)存液，氟康唑從160 μg∕mL至2.5 μg∕mL，兩性霉素B從80 μg∕mL至1.25 μg∕mL，氟胞嘧啶從640 μg∕mL至10 μg∕mL，均為7個(gè)稀釋度，分裝于12 mm×75 mm無菌玻璃試管，每管含0.1 mL抗真菌藥物，每種藥物均設(shè)生長（無藥）對照及空白（陰性）對照。

1.2.2 菌液接種 白假絲酵母菌菌種經(jīng)沙保氏瓊脂培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)2次以上，以激活菌種，挑取3～4個(gè)菌落用生理鹽水制成菌懸液，調(diào)整濁度為0.5麥?zhǔn)蠁挝?，再用高滲液體培養(yǎng)基將此菌懸液稀釋2 000倍（接種菌液濃度約為0.5×103～2.5×103CFU∕mL），在上述含藥試管中各加入0.9 mL菌液。

1.2.3 培養(yǎng)觀察 將接種后的試管置于35℃的恒溫培養(yǎng)箱，每24 h參照藥物稀釋過程繼續(xù)加入0.1 mL的對應(yīng)抗真菌藥物，培養(yǎng)24 h立即讀取每種藥物最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），并每天對試管中培養(yǎng)物進(jìn)行涂片，觀察白假絲酵母菌細(xì)胞壁形態(tài)變化情況。

1.3 結(jié)果判定

1.3.1 MIC判定 因相較于RPMI-1640培養(yǎng)基，高滲液體培養(yǎng)基中營養(yǎng)更豐富，故以24 h為判定終點(diǎn)。與生長對照管對比，氟康唑以80%抑制生長，兩性霉素B和氟胞嘧啶以完全不生長的最低藥物濃度作為MIC。

1.3.2 L型判定 每天涂片進(jìn)行細(xì)胞壁染色，在油鏡下觀察。當(dāng)觀察到白假絲酵母菌染色異?；蚣?xì)胞壁不同程度缺損時(shí)且能通過0.8 μm孔徑的無菌濾器生長判定為其L型，必要時(shí)接種高滲平板分離觀察或進(jìn)行返祖試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 氟康唑誘導(dǎo)結(jié)果 白假絲酵母菌在氟康唑誘導(dǎo)4 d后，在藥物濃度為2 μg∕mL的管中出現(xiàn)細(xì)胞壁不同程度缺損改變（圖1a）或菌體完全深染、皺縮（圖1b），此時(shí)經(jīng)0.8 μm濾器過濾未見生長，若繼續(xù)誘導(dǎo)至第6天，則過濾后有菌生長，涂片后仍可見細(xì)胞壁缺損、菌體深染及皺縮的白假絲酵母菌，其余各管在第7天時(shí)全部過濾均未見生長。此現(xiàn)象表明白假絲酵母菌細(xì)胞壁在早期出現(xiàn)異常改變時(shí)，濾過率或?yàn)V過后存活率低，當(dāng)白假絲酵母菌細(xì)胞壁改變到一定程度可通過0.8 μm的濾器并生長，在第4天觀察到白假絲酵母菌細(xì)胞壁形態(tài)異常時(shí)將其轉(zhuǎn)種至高滲固體平板繼續(xù)培養(yǎng)24 h，發(fā)現(xiàn)部分菌細(xì)胞壁缺損嚴(yán)重，呈“凹坑狀”（圖1c）。

2.2 兩性霉素B和氟胞嘧啶誘導(dǎo)結(jié)果 與氟康唑誘導(dǎo)結(jié)果相似，兩性霉素B誘導(dǎo)4 d后，可在藥物濃度0.5 μg∕mL的管中觀察到細(xì)胞壁輕微缺損的白假絲酵母菌（圖1d），繼續(xù)誘導(dǎo)至第6天時(shí)能通過0.8 μm的濾器生長，涂片細(xì)胞壁染色見大部分白假絲酵母菌細(xì)胞壁完整，說明在抗真菌藥物抑菌作用減縮或消失后，白假絲酵母菌L型能快速恢復(fù)至正常；白假絲酵母菌在氟胞嘧啶誘導(dǎo)1 d后，肉眼可見各管中菌量隨藥物濃度升高而減少，誘導(dǎo)至第2天肉眼可見各管中菌量與生長對照管無明顯差別，說明白假絲酵母菌對氟胞嘧啶耐受較強(qiáng)，氟胞嘧啶對白假絲酵母菌的抑菌作用較差，連續(xù)誘導(dǎo)7 d未觀察到白假絲酵母菌細(xì)胞壁形態(tài)異常改變，過濾各管中培養(yǎng)物均無生長。

圖1 氟康唑和兩性霉素B誘導(dǎo)的白假絲酵母菌L型（細(xì)胞壁染色，10×100）

2.3 不同藥物的MIC及誘導(dǎo)出L型菌的劑量和時(shí)間分析 不同抗真菌藥物分別誘導(dǎo)白假絲酵母菌24 h后，測定各藥物對白假絲酵母菌的MIC。氟康唑的MIC為8 μg∕mL，兩性霉素B的MIC為4 μg∕mL，氟胞嘧啶的MIC為64 μg∕mL。將MIC和誘導(dǎo)情況綜合分析發(fā)現(xiàn)，氟康唑和兩性霉素B連續(xù)誘導(dǎo)4 d，在MIC之后2～3個(gè)對倍濃度的管中均發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁不同程度缺損或染色異常的白假絲酵母菌，繼續(xù)誘導(dǎo)2 d后，可通過0.8 μm的濾器生長；氟胞嘧啶在實(shí)驗(yàn)濃度下誘導(dǎo)7 d未觀察到細(xì)胞壁形態(tài)異常改變的白假絲酵母菌，過濾后無生長，見表1。除氟胞嘧啶外，氟康唑和兩性霉素B均能誘導(dǎo)出白假絲酵母菌L型，且誘導(dǎo)出白假絲酵母菌L型的藥物濃度在MIC之后某個(gè)濃度附近，說明在臨床治療白假絲酵母菌病時(shí)也可能存在其L型，從而對臨床檢驗(yàn)和治療產(chǎn)生干擾。

表1 不同抗真菌藥物誘導(dǎo)情況

3 討論

白假絲酵母菌屬于條件致病菌，在機(jī)體免疫力降低時(shí)，可引起皮膚黏膜及內(nèi)臟器官的感染，尤其對AIDS、結(jié)核病等免疫力低下患者威脅更大，是臨床上感染率和致死率極高的一種真菌〔14〕。由于抗真菌藥物的長期反復(fù)治療，易產(chǎn)生快速耐藥性，給臨床治療白假絲酵母菌病增加了難度。因此，研究抗真菌藥物的潛在作用靶點(diǎn)及白假絲酵母菌的耐藥機(jī)制成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)〔15〕。目前常用的抗真菌藥物中，氟康唑能影響真菌細(xì)胞膜麥角固醇合成的關(guān)鍵酶，阻止麥角固醇的生物合成，兩性霉素B能直接與細(xì)胞膜上的麥角固醇結(jié)合，二者均以導(dǎo)致真菌細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞膜完整性被破壞而產(chǎn)生抗真菌作用；氟胞嘧啶則是通過進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，干擾嘧啶堿基的代謝，抑制真菌核酸的合成而產(chǎn)生抗真菌作用〔16〕。但有學(xué)者認(rèn)為，兩性霉素B對真菌細(xì)胞壁合成具有限速作用，能導(dǎo)致真菌細(xì)胞壁產(chǎn)生適應(yīng)性改變而產(chǎn)生耐藥性〔17〕。氟康唑能導(dǎo)致念珠菌因細(xì)胞壁損傷而膨脹變形，蔡善民等在電鏡下觀察到氟康唑注射液能導(dǎo)致幾種不同念珠菌細(xì)胞壁缺損、扭曲及塌陷變形〔18〕。本研究采用氟康唑、兩性霉素B和氟胞嘧啶3種不同作用機(jī)制的抗真菌藥物，在NCCLS推薦的酵母菌液基稀釋法藥敏試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過模擬臨床給藥周期連續(xù)給藥，在油鏡下觀察對白假絲酵母菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響，結(jié)果顯示，氟康唑和兩性霉素B均能影響白假絲酵母菌細(xì)胞壁的完整性，油鏡下觀察到細(xì)胞壁缺損、菌體深染或皺縮，并能通過0.8 μm的濾器繼續(xù)生長繁殖；氟胞嘧啶在同樣條件下未能誘導(dǎo)出。由于氟康唑和兩性霉素B均作用于真菌細(xì)胞膜，氟胞嘧啶作用于真菌核質(zhì)，因此白假絲酵母菌L型產(chǎn)生可能是抗真菌藥物導(dǎo)致真菌細(xì)胞膜損傷后間接影響其細(xì)胞壁的生物合成，從而導(dǎo)致真菌細(xì)胞壁完整性被破壞。

文獻(xiàn)表明〔19〕，真菌受抗真菌藥物、人體內(nèi)溶菌酶或其他因素的作用，能形成與細(xì)菌L型相似的缺壁型，真菌的缺壁型仍具有生命力和一定的致病性，在影響因素消除后，能快速恢復(fù)，當(dāng)其細(xì)胞壁缺損嚴(yán)重時(shí)，菌體易發(fā)生變形，可通過0.8 μm的濾器。但對抗真菌藥物誘導(dǎo)真菌形成L型的劑量和時(shí)間條件并未深入研究，有關(guān)真菌L型存在形態(tài)的圖像資料也有局限性。因此，本研究利用改良細(xì)胞壁染色法，在油鏡下觀察不同藥物濃度和時(shí)間條件下抗真菌藥物誘導(dǎo)白假絲酵母菌形成L型的形態(tài)改變情況，發(fā)現(xiàn)氟康唑和兩性霉素B分別作用4 d后，能在最低抑菌濃度之后2個(gè)對倍濃度觀察到細(xì)胞壁呈明顯缺損的白假絲酵母菌L型，主要表現(xiàn)為“凹坑狀”、菌體深染或皺縮。據(jù)馬晟利等〔20〕報(bào)道，血鏈球菌細(xì)菌素作用念珠菌24 h可導(dǎo)致念珠菌細(xì)胞膜通透性和菌體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，電鏡下可見菌體細(xì)胞皺縮，質(zhì)壁分離，菌體細(xì)胞膜及細(xì)胞壁凹坑狀缺損，細(xì)胞壁及細(xì)胞膜連續(xù)性破壞或斷裂等不同形態(tài)改變。本實(shí)驗(yàn)在油鏡下的觀察結(jié)果與之相似，盡管血鏈素抑菌機(jī)制還未完全闡明，但現(xiàn)階段研究表明，血鏈素和氟康唑、兩性霉素B等抗真菌藥均能促使白假絲酵母菌細(xì)胞膜通透性改變，導(dǎo)致細(xì)胞壁形態(tài)變化，形成L型菌。

本研究還發(fā)現(xiàn)，雖然在特定藥物濃度和時(shí)間條件下，白假絲酵母菌細(xì)胞壁可發(fā)生不同程度的缺失，但仍然能通過自身修復(fù)繁殖。將白假絲酵母菌L型轉(zhuǎn)種到高滲固體平板或沙保氏瓊脂培養(yǎng)基，大部分白假絲酵母菌均能恢復(fù)完整細(xì)胞壁，經(jīng)0.8 μm的濾器過濾后觀察生長的白假絲酵母菌L型，僅能在較少視野中發(fā)現(xiàn)，大部分念珠菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整。白假絲酵母菌的L型可能是抗真菌藥持續(xù)作用時(shí)，少數(shù)白假絲酵母菌與抗真菌藥物之間形成的一種暫時(shí)平衡狀態(tài)，當(dāng)藥物作用減弱或消失后便能迅速恢復(fù)完整的細(xì)胞壁，可能在此平衡狀態(tài)白假絲酵母菌能較好耐受抗真菌藥物而不被殺死，對其具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

〔1〕張群智，周惠平.L型菌的培養(yǎng)、藥敏與其所致感染性疾病的研究進(jìn)展〔J〕.大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，2（1）：82-84.

〔2〕尹秀華，王麗波，陶梅花，等.常用抗菌藥物對常見致病菌L型誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，14（2）：21-23.

〔3〕朱德全，段新美，王中琰.血和腦脊液同時(shí)分離出L型克柔氏念珠菌2例〔J〕.上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，1994，9（3）：157.

〔4〕張楊，張效正，李霞，等.熱帶念珠菌L型的分離與鑒定〔J〕.微生物學(xué)通報(bào)，1995，22（2）：86-87.

〔5〕董海新，叢鑫.克柔念珠菌L型引起急性腎盂腎炎一例〔J〕.上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，1997，12（4）：217.

〔6〕張?jiān)?白色念珠菌L型的誘導(dǎo)初步探討〔J〕.臨床檢驗(yàn)雜志，1989，7（1）：18.

〔7〕張宏，黃谷良，林特夫，等.新型隱球菌L型的誘導(dǎo)與形態(tài)學(xué)觀察〔J〕.蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1989，14（4）：231-235.

〔8〕張宏，黃谷良，林特夫，等.新生隱球菌L型致病性的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中華皮膚科雜志，1995，28（3）：158-160.

〔9〕張宏，黃谷良，林特夫，等.新生隱球菌L型生物學(xué)性狀研究〔J〕.中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2006，22（1）：36-38.

〔10〕蒼金榮，任健康，王華，等.唑類抗真菌藥物誘導(dǎo)白色念珠菌L型的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2006，21（5）：42-43.

〔11〕席麗艷，郭寧如，沈永年，等.白念珠菌L型研究初報(bào)〔J〕.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，1992，14（4）：305-309.

〔12〕王梅竹，王和.細(xì)胞壁染色法的改良及真菌細(xì)胞壁染色觀察〔J〕.貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，29（5）：460-461.

〔13〕陳兆芳，武有聰，白麗.體外酵母樣真菌藥物敏感性試驗(yàn)方法研究進(jìn)展〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述，2009，15（12）：1873-1875.

〔14〕CRUNKHORN S.Fungal infection：Protecting from Candi?da albicans.〔J〕.Nat Rev Drug Discov，2016，15（9）：604.

〔15〕姜遠(yuǎn)英，劉偉，曹永兵.念珠菌的耐藥機(jī)制及應(yīng)對策略研究〔J〕.中國真菌學(xué)雜志，2011，6（4）：193-198.

〔16〕謝海偉，楊賢松，呂超田，等.抗真菌藥物及其作用機(jī)制研究〔J〕.中國微生態(tài)學(xué)雜志，2015，27（12）：1477-1479.

〔17〕楊芳，申元英.抗真菌藥物耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展〔J〕.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2015，25（18）：4317-4320.

〔18〕蔡善民，陳文列，鐘秀容.國產(chǎn)氟康唑?qū)δ钪榫幬镒饔玫某⒔Y(jié)構(gòu)研究〔J〕.電子顯微學(xué)報(bào)，2007，26（3）：217-220.

〔19〕張?jiān)?，張宏，黃谷良.真菌的L型〔J〕.中國微生態(tài)學(xué)雜志，1990，2（4）：77-79.

〔20〕馬晟利，趙英男，夏雪，等.血鏈球菌細(xì)菌素對念珠菌菌體細(xì)胞膜通透性及超微結(jié)構(gòu)的影響〔J〕.口腔醫(yī)學(xué)研究，2014，30（1）：21-26.