雷新環(huán) 李芷嫣 黃微星 蔡國平 米爽 洪盾 章禮煒

骨質(zhì)疏松癥是由于骨重建過程中骨吸收和骨形成的平衡被打破，導(dǎo)致骨量下降，骨密度降低而引起的一系列臨床癥狀。破骨細(xì)胞的數(shù)量和活性決定骨吸收的持續(xù)時(shí)間和發(fā)展速度，在骨質(zhì)疏松癥發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用[1-2]。既往體內(nèi)外研究表明許多中藥單體諸如淫羊藿等可通過抑制破骨細(xì)胞分化、促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化等途徑治療骨質(zhì)疏松[3-4]。冬凌草甲素是一種二萜類化合物的中藥單體，具有抗腫瘤、抗菌、抗炎等作用，但其能否影響破骨細(xì)胞分化目前尚不清楚[5]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究中藥單體冬凌草甲素抑制破骨細(xì)胞分化的作用及其可能的作用機(jī)制，為其治療骨質(zhì)疏松癥提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡雌性C57BL/6小鼠購自上海斯萊克動(dòng)物有限公司。

1.2 材料 冬凌草甲素（大連美侖生物技術(shù)有限公司，配制成200mM母液）；巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）、NF-κB受體活化因子配體（RANKL）購自美國R&D公司；alpha MEM、FBS購自美國Gibco公司；CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色試劑盒購自美國sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 骨髓巨噬細(xì)胞（bone marrow-derived macrophages,BMMs）的分離、培養(yǎng)及破骨細(xì)胞誘導(dǎo) 處死小鼠后分離出股骨和脛骨，用培養(yǎng)基沖出骨髓腔內(nèi)的細(xì)胞后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含30ng/ml M-CSF的 alpha MEM（含 10%FBS），隔天換液，培養(yǎng)3～5d，獲得BMMs。根據(jù)不同需要，BMMs傳代種板，用含 50ng/ml RANKL、30ng/ml M-CSF的 alpha MEM 培養(yǎng)，隔天換液，直至分化為成熟的破骨細(xì)胞。

1.3.2 CCK-8法檢測(cè)冬凌草甲素對(duì)BMMs增殖的影響 收集對(duì)數(shù)生長期的BMMs，種入96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，細(xì)胞密度為8×103/孔，每板共30孔，分為對(duì)照組和9 組添加不同濃度（0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4和12.8μM）冬凌草甲素的藥物組，每組3個(gè)復(fù)孔；在含30ng/ml M-CSF的 alpha MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng) 48、72、96h。然后每孔加入10μl CCK-8溶液，在培養(yǎng)基內(nèi)再次培養(yǎng)2h后使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔450nm處吸光度（OD）值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，細(xì)胞存活率計(jì)算公式：細(xì)胞存活率=（對(duì)照組OD值-藥物組OD值）/對(duì)照組OD值。

1.3.3 破骨細(xì)胞分化和TRAP染色 收集對(duì)數(shù)生長期的BMMs，種入96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，細(xì)胞密度為1×104/孔，細(xì)胞在含 50ng/ml RANKL、30ng/ml M-CSF的 alpha MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對(duì)照組不加藥，藥物組濃度由前述CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定為0.8、0.4μM（排除冬凌草甲素對(duì)BMMs增殖的抑制作用），隔天換液。當(dāng)對(duì)照組已經(jīng)有明顯的破骨細(xì)胞形成時(shí)培養(yǎng)終止，吸去培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛每孔100μl固定細(xì)胞20min后，PBS緩沖液沖洗2遍，行TRAP染色，在倒置熒光顯微鏡下（100×和 200×）觀察，計(jì)算 TRAP（+）且細(xì)胞核數(shù)目 3 個(gè)以上的破骨細(xì)胞數(shù)量目和鋪展率并拍照分析，其中鋪展面積使用ImageJ v.1.51軟件計(jì)算，鋪展率=鋪展面積/同一視野總面積。

1.3.4 破骨細(xì)胞降鈣素受體（CTR）、組織蛋白酶K（CTSK）、活性 T細(xì)胞核因子 c1（NFATc1）mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用qRT-PCR法。收集對(duì)數(shù)生長期的BMMs細(xì)胞，種入6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，細(xì)胞密度為20×104/孔，細(xì)胞在含 50ng/ml RANKL、30ng/ml M-CSF的 alpha MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對(duì)照組不加藥，藥物組濃度為0.8、0.4μM，隔天換液至第4天。應(yīng)用Trizol試劑提取細(xì)胞的總RNA并測(cè)定濃度后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，設(shè)計(jì)引物，GAPDH上游:5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′,下 游 :5′-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3′;CTR 上游:5′-TGCAGACAACTCTTG GTTGG-3 ′，下 游 :5′-TCGGTTTCTTCTCCTCTGGA-3′；CTSK 上游:5′-CTTCCAATACGTGCAGCAGA-3′，下 游 :5′-TCTTCAGGGCTTTCTCGTTC-3′；NFATc1 上游:5′-CCGTTGCTTCCAGAAAATAACA-3′，下 游 :5′-TGTGGGATGTGAACTCGGAA-3′。對(duì)待測(cè)樣品的待測(cè)基因行qRT-PCR，反應(yīng)體系為20μ（lSYBR Green Mister 10μl，正向引物 1μl,反向引物 1μl，cDNA 0.5μl，ddH2O 7.5μl），反應(yīng)條件為 95℃ 5min，94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 60s，循環(huán)35次。結(jié)果表示及分析使用2-ΔΔCT法。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 破骨細(xì)胞鑒定 BMMs在含50ng/ml RANKL、30ng/ml M-CSF的alpha MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)6d后，用TRAP染色，對(duì)照組在倒置熒光顯微鏡下可見大量細(xì)胞為多個(gè)核細(xì)胞（≥3個(gè)），胞體較大，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、邊緣不規(guī)整，有偽足伸出，胞質(zhì)中出現(xiàn)較多的紫紅色顆粒，表明用BMMs成功誘導(dǎo)出破骨細(xì)胞。

2.2 冬凌草甲素抑制BMMs增殖 與對(duì)照組相比，經(jīng)不同濃度冬凌草甲素處理48、72h后，濃度＞6.4μM的冬凌草甲素有抑制BMMs增殖的作用，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；經(jīng)冬凌草甲素處理96h后，濃度＞3.2μM的冬凌草甲素有抑制BMMs增殖的作用，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見圖1和表1。

2.3 冬凌草甲素抑制破骨細(xì)胞分化成熟 由于96h CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示濃度＞3.2μM冬凌草甲素對(duì)BMMs增殖有明顯抑制作用，故筆者選用濃度低于3.2μM作為藥物組篩選其是否可抑制破骨細(xì)胞的分化。在倒置相差顯微鏡下觀察可見BMMs經(jīng)6d M-CSF和RANKL共同誘導(dǎo)后行TRAP染色，對(duì)照組出現(xiàn)成熟肥大且細(xì)胞核＞3個(gè)的破骨細(xì)胞，而藥物組（0.4、0.8μM冬凌草甲素）中破骨細(xì)胞分化過程明顯受到抑制。倒置相差顯微鏡下統(tǒng)計(jì)TRAP（+）且細(xì)胞核數(shù)目3個(gè)或3個(gè)以上的破骨細(xì)胞數(shù)量和鋪展率，發(fā)現(xiàn)藥物組破骨細(xì)胞數(shù)目和鋪展率較對(duì)照組均明顯減少（均P＜0.01），并呈明顯劑量依賴性，見圖2（插頁）、圖3和表2。

2.4 各組破骨細(xì)胞CTR、CTSK、NFATc1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較 與對(duì)照組相比，0.4、0.8μM冬凌草甲素藥物組中CTR、CTSK、NFATc1的mRNA的表達(dá)水平均明顯降低（均P＜0.01），且呈劑量依賴性，見圖4。

圖1 BMMs經(jīng)不同濃度冬凌草甲素處理48、72、96h后細(xì)胞存活率（a：BMMs經(jīng)不同濃度冬凌草甲素處理48h；b：BMMs經(jīng)不同濃度冬凌草甲素處理72h；c：BMMs經(jīng)不同濃度冬凌草甲素處理96h；與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

表1 BMMs經(jīng)不同濃度冬凌草甲素處理48、72、96h后的OD值變化

圖3 經(jīng)不同濃度冬凌草甲素處理后破骨細(xì)胞數(shù)目和鋪展率比較（a：經(jīng)不同濃度冬凌草甲素處理后破骨細(xì)胞數(shù)目比較；b：經(jīng)不同濃度冬凌草甲素處理后破骨細(xì)胞鋪展率比較；與對(duì)照組比較，**P＜0.01）

表2 經(jīng)不同濃度冬凌草甲素處理后破骨細(xì)胞數(shù)目和鋪展率的比較

3 討論

骨質(zhì)疏松癥現(xiàn)已是老年人常見的慢性病之一，破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收和成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成失衡，導(dǎo)致骨密度降低、骨量減少，是骨質(zhì)疏松癥的重要原因。干擾破骨細(xì)胞的分化、增殖、活化、凋亡的任一過程，均能影響破骨細(xì)胞的功能，導(dǎo)致骨吸收的增強(qiáng)或減弱[1,6]。因此，干擾破骨細(xì)胞的分化增殖是是抑制骨吸收的有效方法。

冬凌草甲素是從唇形科香菜屬植物中分離出的一種二萜類天然有機(jī)化合物。冬凌草甲素因其具有良好的抑制腫瘤生長轉(zhuǎn)移、抗血管生成、抑制免疫反應(yīng)等作用被人們熟知[7-11]。本研究觀察了冬凌草甲素對(duì)BMMs細(xì)胞增殖的影響及其在RANKL誘導(dǎo)下往破骨細(xì)胞分化的影響，結(jié)果表明冬凌草甲素能夠使TRAP（+）破骨細(xì)胞數(shù)目和鋪展率明顯減少，qRT-PCR顯示破骨細(xì)胞相關(guān)基因CTR、CTSK、NFATc1的mRNA表達(dá)水平也明顯下調(diào)，上述結(jié)果顯示冬凌草甲素對(duì)BMMs的增殖和破骨細(xì)胞的分化具有明顯的抑制作用。

BMMs是破骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，在50ng/ml RANKL、30ng/ml M-CSF等誘導(dǎo)因子的作用下分化成為破骨細(xì)胞。RANKL是破骨細(xì)胞分化成熟和維持功能的重要細(xì)胞因子，在骨重建中發(fā)揮著重要的作用，可以促進(jìn)破骨細(xì)胞分化成熟，增加破骨細(xì)胞活性，阻止破骨細(xì)胞凋亡。目前發(fā)現(xiàn)的破骨細(xì)胞內(nèi)與RANKL相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要有4條：NF-κB通路、MAPK通路、PI3K/Akt通路和CN/NFAT通路，且共同激活下游NFATc1轉(zhuǎn)錄因子[12-13]。CTR、CTSK、NFATc1是成熟破骨細(xì)胞特異性表達(dá)的重要基因，RANKL和M-CSF能與BMMs表面的RANK和M-CSF結(jié)合，激活NFATc1、NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子，引起下游的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，合成CTR、CTSK、TRAP等，并促進(jìn)骨溶解[12-14]。

圖4 不同濃度冬凌草甲素處理后CTR、CTSK、NFATc1mRNA相對(duì)表達(dá)水平（a：不同濃度冬凌草甲素處理后CTR mRNA相對(duì)表達(dá)水平；b：不同濃度冬凌草甲素處理后CTSK mRNA相對(duì)表達(dá)水平；c：不同濃度冬凌草甲素處理后NFATc1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平；與對(duì)照組比較，**P＜0.01）

綜上所述，本研究顯示冬凌草甲素對(duì)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞BMMs的增殖及向破骨細(xì)胞的分化具有抑制作用，其可能的機(jī)制為冬凌草甲素可通過抑制破骨細(xì)胞相關(guān)基因CTR、CTSK、NFATc1的mRNA表達(dá)水平，起到防治破骨細(xì)胞相關(guān)疾病的作用。本實(shí)驗(yàn)僅在體外條件下研究了冬凌草甲素對(duì)破骨細(xì)胞增殖分化的影響，還需在動(dòng)物體內(nèi)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

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