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        干擾Twist基因?qū)σ认侔㏄ANC1細(xì)胞糖酵解的影響及機(jī)制研究

        2018-06-28 12:13:22黃驛勝王競(jìng)楓林楓李林立葉啟文林峰張代場(chǎng)
        中華胰腺病雜志 2018年3期
        關(guān)鍵詞:丙酮酸糖酵解激酶

        黃驛勝 王競(jìng)楓 林楓 李林立 葉啟文 林峰 張代場(chǎng)

        Twist是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,在胚胎發(fā)育過(guò)程中具有重要作用[1]。最近的研究表明,Twist在腫瘤發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮癌基因的作用,其在肺癌、胰腺癌、卵巢癌、膽管癌等癌組織中過(guò)度表達(dá),干擾Twist后,癌細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制[2-3]。癌細(xì)胞能量代謝與正常細(xì)胞不同,主要以糖酵解形式供能,丙酮酸激酶、己糖激酶是糖酵解途徑中的關(guān)鍵限速酶,糖酵解過(guò)程中乳酸分泌增加。研究顯示,Twist能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞能量代謝。蛋白質(zhì)組學(xué)和mRNA芯片顯示,MCF10A-Twist細(xì)胞中與葡萄糖相關(guān)的基因發(fā)生了變化,Twist和Akt的啟動(dòng)子可以相結(jié)合,增加其活化水平,影響Akt信號(hào)通路激活,而Akt信號(hào)通路的激活又參與腫瘤細(xì)胞糖酵解途徑[4-7]。本研究以胰腺癌PANC1細(xì)胞為研究對(duì)象,采用mRNA干擾方法抑制細(xì)胞Twist基因的表達(dá),探討Twsit基因?qū)σ认侔┘?xì)胞糖酵解及增殖的影響。

        材料與方法

        一、材料

        RPMI1640培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;新生牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品;陰性對(duì)照siRNA(siRNA-NC)和靶向Twist基因的siRNA(siRNA-Twist)為英國(guó)Abbexa公司產(chǎn)品;Twist、β肌動(dòng)蛋白(β-actin)引物由金斯瑞生物科技有限公司合成;Twist多克隆抗體、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)多克隆抗體、磷酸化的Akt(p-Akt)多克隆抗體均為英國(guó) abcam公司產(chǎn)品;細(xì)胞蛋白提取試劑盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒均為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品;丙酮酸激酶活性檢測(cè)試劑盒、己糖激酶活性檢測(cè)試劑盒、乳酸含量檢測(cè)試劑盒均為北京Solarbio公司產(chǎn)品。

        二、細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

        胰腺癌PANC1細(xì)胞購(gòu)于中科院細(xì)胞庫(kù)。PANC1細(xì)胞培養(yǎng)用含有青霉素和鏈霉素各100 U/ml、10%新生牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng),細(xì)胞傳代用0.25%的胰蛋白酶消化,培養(yǎng)條件為飽和濕度,37℃、5% CO2培養(yǎng)箱。

        取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC1細(xì)胞,接種于6孔板,每孔2×105個(gè)細(xì)胞,待細(xì)胞60%融合時(shí),將培養(yǎng)液換成不含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液,孵育60 min。應(yīng)用脂質(zhì)體方法將siRNA分別轉(zhuǎn)染PANC1細(xì)胞,按Lipofectamine2000試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對(duì)照組。轉(zhuǎn)染6 h后更換為含有胎牛血清的培養(yǎng)液,轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。

        三、Twist mRNA表達(dá)檢測(cè)

        取上述轉(zhuǎn)染48 h的各組PANC1細(xì)胞,采用Trizol提取總RNA,先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,再行實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)Twist mRNA表達(dá)。Twist正義序列為5′-GTCCGCAGTCTTACGAGGAG-3′,反義序列為5′-GCTTGAGGGTCGAATCTTGCT-3′;內(nèi)參β-actin正義序列為5′-GGACCTGACTGACTACCTC-3′,反義序列為5′-TACTCCTGCTTGCTGAT-3′。PCR反應(yīng)條件:94℃ 120 s,94℃ 30 s、57℃ 30 s、72℃ 120 s,30個(gè)循環(huán)。由儀器自帶軟件獲取Ct值,應(yīng)用公式2-△△Ct計(jì)算Twist mRNA相對(duì)表達(dá)量,以對(duì)照組表達(dá)量為1。

        四、Twist及Akt、p-Akt蛋白表達(dá)檢測(cè)

        取上述3組培養(yǎng)48 h的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,提取細(xì)胞蛋白,BCA定量后常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞Twist、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)水平。一抗工作濃度均為1∶800,二抗為1∶2 000。以目的條帶與β-actin條帶的灰度值比表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

        五、細(xì)胞增殖的檢測(cè)

        取上述3組培養(yǎng)48 h的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,以2×103/孔的密度接種至96孔培養(yǎng)板,每組設(shè)置7個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后,每孔中加入5 mg/ml的MTT 20 μl,37℃孵育4 h,棄去上清液,加入150 μl的二甲基亞砜溶液,震蕩反應(yīng)10 min,上酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm處的吸光度值(A490值),計(jì)算細(xì)胞存活率,同時(shí)以不加細(xì)胞的孔調(diào)零。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組A490值/對(duì)照組A490值)×100%。

        六、丙酮酸激酶、己糖激酶活性檢測(cè)

        上述3組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,檢測(cè)丙酮酸激酶和己糖激酶的活性,按丙酮酸激酶和己糖激酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

        七、乳酸分泌量檢測(cè)

        上述3組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,取培養(yǎng)液上清,用乳酸含量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)乳酸分泌水平。

        八、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        結(jié) 果

        一、轉(zhuǎn)染后PANC1細(xì)胞Twist基因表達(dá)

        對(duì)照組、siRNA-NC組和siRNA-Twist組Twist mRNA表達(dá)量分別為1.00±0.09、1.01±0.08、0.36±0.02,蛋白表達(dá)量分別為0.41±0.05、0.42±0.04、0.12±0.06。siRNA-NC組與對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而siRNA-Twist組顯著低于對(duì)照組及siRNA-NC組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05,圖1)。

        圖1 對(duì)照組(1)、siRNA-NC組(2)、siRNA-Twist組(3)Twist蛋白表達(dá)

        二、轉(zhuǎn)染后PANC1細(xì)胞的存活率

        培養(yǎng)48 h后,對(duì)照組、siRNA-NC組和siRNA-Twist組細(xì)胞存活率分別為(100.02±9.36)%、(100.01±10.25)%、(59.32±7.26)%。siRNA-NC組與對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而siRNA-Twist組顯著低于對(duì)照組及siRNA-NC組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。

        三、轉(zhuǎn)染后PANC1細(xì)胞的丙酮酸激酶、己糖激酶活性及乳酸含量

        對(duì)照組、siRNA-NC組和siRNA-Twist組細(xì)胞的丙酮酸激酶活性分別為(0.73±0.05)、(0.72±0.08)、(0.43±0.05)U/mg,己糖激酶活性分別為(4.98±0.48)、(4.96±0.52)、(2.54±0.21)U/mg,乳酸含量分別為(20.36±2.61)、(20.64±3.05)、(9.48±1.09)mmol/L。siRNA-NC組丙酮酸激酶、己糖激酶活性及乳酸含量與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05),siRNA-Twist組較對(duì)照組及siRNA-NC組顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。

        四、轉(zhuǎn)染后PANC1細(xì)胞Akt、p-Akt蛋白表達(dá)

        對(duì)照組、siRNA-NC組和siRNA-Twist組p-Akt/Akt蛋白比值分別為0.65±0.04、0.63±0.07、0.25±0.04。siRNA-NC組p-Akt/Akt比值與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),siRNA-Twist組較對(duì)照組及siRNA-NC組顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05,圖2)。

        圖2 對(duì)照組(1)、siRNA-NC組(2)、siRNA-Twist組(3)組Akt、p-Akt表達(dá)

        討 論

        Twist是一種高度保守的螺旋-環(huán)-螺旋家族的成員之一,由1個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子組成,其編碼的蛋白由202個(gè)氨基酸組成,在胚胎發(fā)育的早期發(fā)揮調(diào)控作用[8]。近年研究表明,Twist參與腫瘤的發(fā)生,與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等有關(guān)[9]。Ohuchida等[10]研究顯示,Twist在胰腺癌中表達(dá)上調(diào),且Twist蛋白表達(dá)水平與淋巴結(jié)分期有關(guān),與患者的年齡、性別、腫瘤分化程度無(wú)關(guān)。張娟等[11]通過(guò)干擾結(jié)腸癌細(xì)胞Twist表達(dá)后發(fā)現(xiàn),下調(diào)Twist能夠體外抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖并減弱結(jié)腸癌細(xì)胞裸鼠成瘤能力。Wang等[12]報(bào)道,干擾宮頸癌細(xì)胞Twist表達(dá)24 h后對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率超過(guò)25%。這些研究結(jié)果均提示,Twsit下調(diào)后能抑制癌細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果顯示,干擾Twist表達(dá)后胰腺癌細(xì)胞的存活率下降,細(xì)胞增殖能力降低,與文獻(xiàn)報(bào)道相符。

        癌細(xì)胞與正常細(xì)胞不同,其在氧氣充足的情況下也以糖酵解的方式提供能量,這種方式也被稱(chēng)為Warburg效應(yīng)[13]。糖酵解過(guò)程中,葡萄糖和糖原分解成丙酮酸,在此過(guò)程中伴有ATP的產(chǎn)生,己糖激酶是首個(gè)限速酶,而丙酮酸激酶調(diào)控糖酵解有氧氧化的轉(zhuǎn)化[14]。有研究表明,己糖激酶、丙酮酸激酶在腫瘤組織中廣泛表達(dá)[15]。乳酸是糖酵解的最終產(chǎn)物,檢測(cè)乳酸含量是評(píng)價(jià)糖酵解水平的重要方法。Chen等[16]研究表明,乳腺癌細(xì)胞中丙酮酸激酶、己糖激酶含量升高,乳酸分泌量增加。本研究結(jié)果顯示,干擾Twist后胰腺癌細(xì)胞中丙酮酸激酶、己糖激酶活性降低,乳酸分泌量減少,提示干擾Twist能夠抑制胰腺癌細(xì)胞的糖酵解。

        Akt信號(hào)通路與細(xì)胞的生長(zhǎng)、能量代謝等有關(guān),在多種組織和器官中均發(fā)揮調(diào)控作用。Akt磷酸化后,其信號(hào)通路激活,從而發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用[17]。Cao等[18]的研究表明,抑制Akt信號(hào)通路后,胃癌細(xì)胞的增殖能力降低。Yang等[19]的研究表明,miRNA-21能夠通過(guò)影響Akt信號(hào)通路調(diào)控膀胱癌細(xì)胞糖酵解。本研究結(jié)果顯示,干擾Twsit能夠下調(diào)p-Akt的水平從而影響胰腺癌細(xì)胞的增殖和糖酵解。

        參 考 文 獻(xiàn)

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