陳樹俊，李 樂，胡 潔，徐曉霞，石 玥，李佳益，張君梅，王翠連

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

核桃具有很高的營養(yǎng)和保健價(jià)值[1-2]。核桃多肽作為一種植物蛋白多肽具有還原能力強(qiáng)、溶解性高、抑菌性好等多種生理活性，且在食品、保健品、醫(yī)藥等行業(yè)中有較為廣泛的應(yīng)用[3-4]?？嗍w是一種獨(dú)特的食藥兩用作物之一，富含優(yōu)質(zhì)蛋白及黃酮、多酚、膳食纖維等多種營養(yǎng)成分，具有降血脂、降血糖、抗癌抑瘤、抗氧化等保健功能[5]。藜麥?zhǔn)且环N富含鈣、硒、鐵、鉀、鋅等多種礦物質(zhì)的“類全谷物”[6]，酚類物質(zhì)含量高于其他一般谷物，具有良好的開發(fā)前景[7-8]。現(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)理論認(rèn)為，蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值與氨基酸組成密切相關(guān)，氨基酸組成越接近其必需氨基酸組成模式，越接近標(biāo)準(zhǔn)蛋白，其營養(yǎng)價(jià)值越高[9]。張金振等[10]采用國際上通用的營養(yǎng)價(jià)值評價(jià)方法對13 種植物蜂花粉蛋白質(zhì)進(jìn)行了綜合評價(jià)。胡秋輝等[11]根據(jù)蛋白質(zhì)互補(bǔ)作用原理研究并評價(jià)了富硒米糠蛋白的營養(yǎng)復(fù)配。王芳等[12]以聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織與世界衛(wèi)生組織（United Nations Food Agriculture Organization/World Health Organization，F(xiàn)AO/WHO）氨基酸模式為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)全面評價(jià)了桑葉蛋白的營養(yǎng)價(jià)值。國內(nèi)外有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的研究方向較少，局限于評價(jià)單一食品或植物蛋白的營養(yǎng)價(jià)值，對于谷物蛋白的復(fù)配鮮為報(bào)道。

谷物淀粉加水糊化溶液黏稠，通過添加適當(dāng)?shù)矸勖缚梢运獬尚》肿犹?，從而降低黏稠度，取代食品中添加糖，更有利于人體消化吸收。徐曉霞等[13]根據(jù)蛋白質(zhì)互補(bǔ)理論確定了苦蕎、燕麥、杏鮑菇最佳復(fù)配比，并對復(fù)合粉進(jìn)行液化和糖化工藝的研究。劉曉娟等[14]對苦蕎、燕麥復(fù)合粉進(jìn)行糊化、液化、糖化，研制出一種輔助食品。陳樹俊等[15]以小米、藜麥為原料探討了二者復(fù)配后最佳液化、糖化條件及乳化劑、增稠劑對體系穩(wěn)定性的影響。本實(shí)驗(yàn)借鑒前人經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值評價(jià)方法確定出核桃多肽-苦蕎-藜麥最佳復(fù)配比例，先對苦蕎藜麥復(fù)合粉進(jìn)行糊化、液化、糖化，將淀粉大分子水解為小分子糖，再按照科學(xué)配比加入易于消化吸收的核桃多肽，經(jīng)噴霧干燥后得到核桃多肽-苦蕎-藜麥復(fù)合營養(yǎng)粉，在此基礎(chǔ)上對復(fù)合粉進(jìn)行了體外模擬消化和抗氧化功能特性的研究。旨在為大多數(shù)人群提供一種易于消化吸收且具有較高營養(yǎng)價(jià)值和抗氧化功能的輔助食品，為今后的相關(guān)研究提供一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃多肽液 山西大學(xué)生物工程基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室自制[16]；苦蕎粉 山西佳鑫食業(yè)有限責(zé)任公司；藜麥粉山西稼祺農(nóng)業(yè)科技有限公司；α-淀粉酶（3 700 U/g）、β-淀粉酶（100 000 U/g）、糖化酶（100 000 U/g）、胃蛋白酶（10 000 U/g）、胰蛋白酶（250 000 U/g） 北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖、碘、碘化鉀、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、氫氧化鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、硫酸亞鐵（均為分析純） 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國Sigma公司；總抗氧化能力（T-AOC）檢測試劑盒 南京建成生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

835-50型高速氨基酸分析儀 日本日立公司；YC-1800型實(shí)驗(yàn)室噴霧干燥機(jī) 上海雅程儀器設(shè)備有限公司；WFZ UV-2100型紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋 興化市佳明儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 常規(guī)營養(yǎng)成分的測定

蛋白質(zhì)含量的測定：凱氏定氮法（GB/T 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》）；淀粉含量的測定：酸水解法（GB/T 5009.9—2008《食品中淀粉的測定》）；氨基酸含量的測定：GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》。

1.3.2 其他成分的測定

糊化度測定采用酶水解法[17]；還原糖含量測定采用DNS法[18]；多肽、黃酮和多酚含量測定參見文獻(xiàn)[19-21]。

1.3.3 蛋白質(zhì)的評價(jià)

采用朱圣陶等[22]推薦的評價(jià)方法，將苦蕎和藜麥蛋白按不同比例復(fù)合，計(jì)算不同比例復(fù)合后待測蛋白各必需氨基酸含量，選擇FAO/WHO氨基酸模式評價(jià)待測蛋白與參考蛋白接近程度。按照公式（1）～（4）依次計(jì)算待測蛋白氨基酸比值（ratio of amino acid，RAA）、氨基酸比值系數(shù)（ratio coeff i cient of amino acid，RCAA）和氨基酸比值系數(shù)分（score of ratio coeff i cient of amino acid，SRCAA），從而確定苦蕎和藜麥蛋白最適質(zhì)量比。在此基礎(chǔ)上，將核桃蛋白和最佳比例復(fù)合后的苦蕎藜麥蛋白按照不同比例復(fù)合，重復(fù)上述計(jì)算過程進(jìn)而確定核桃蛋白和苦蕎藜麥蛋白的最適質(zhì)量比，根據(jù)核桃多肽、苦蕎和藜麥原料的蛋白含量，通過折算，最終確定3 種原料的最佳復(fù)配比。

1.3.4 苦蕎-藜麥復(fù)配谷物液化條件的確定

1.3.4.1 苦蕎-藜麥復(fù)配谷物液化單因素試驗(yàn)

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)對樣品糊化過程進(jìn)行簡便快捷的趨勢分析，即以糊化度為指標(biāo)，根據(jù)單因素試驗(yàn)確定了苦蕎-藜麥粉最佳糊化條件為料液比1∶9（g/mL）、溫度80 ℃、時(shí)間50 min。

在糊化的基礎(chǔ)上，以還原糖質(zhì)量濃度為指標(biāo)，考察α-淀粉酶添加量（4、5、6、7、8 U/g），溫度（50、60、70、80、90 ℃），時(shí)間（20、30、40、50、60 min）3 個因素對液化效果的影響，固定初始液化條件為α-淀粉酶添加量6 U/g、溫度70 ℃、時(shí)間40 min，利用控制變量法進(jìn)行條件篩選。

1.3.4.2 苦蕎-藜麥復(fù)配谷物液化正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以還原糖質(zhì)量濃度為指標(biāo)，選擇α-淀粉酶添加量、溫度和時(shí)間進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 液化正交試驗(yàn)因素與水平Table1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used in orthogonal array design for optimization of liquefaction conditions

1.3.5 苦蕎-藜麥復(fù)配谷物糖化條件的確定

1.3.5.1 苦蕎-藜麥復(fù)配谷物糖化單因素試驗(yàn)

在液化基礎(chǔ)上，以還原糖質(zhì)量濃度為指標(biāo)，考察β-淀粉酶添加量（50、100、150、200、250 U/g），溫度（50、55、60、65、70 ℃），時(shí)間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）3 個因素對糖化效果的影響，固定初始糖化條件為β-淀粉酶添加量150 U/g、溫度60 ℃、時(shí)間2.0 h，利用控制變量法進(jìn)行條件篩選。

1.3.5.2 苦蕎-藜麥復(fù)配谷物糖化正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以還原糖質(zhì)量濃度為指標(biāo)，選擇β-淀粉酶添加量、溫度和時(shí)間進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，因素及水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 糖化正交試驗(yàn)因素與水平Table2 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used in orthogonal array design for optimization of saccharif i cation conditions

1.3.6 核桃多肽-苦蕎-藜麥復(fù)合粉的制備

調(diào)整噴霧干燥參數(shù)為噴霧壓力0.1～0.3 MPa，風(fēng)機(jī)設(shè)定20～30，溫度110～150 ℃，蠕動泵轉(zhuǎn)速15～30 r/min，對核桃多肽液進(jìn)行噴霧干燥制備出核桃多肽粉。將核桃多肽粉與苦蕎-藜麥糊化液化糖化后的濃漿按原料最佳質(zhì)量比混勻，進(jìn)行噴霧干燥，得到核桃多肽-苦蕎-藜麥經(jīng)酶解后各種小分子糖的復(fù)合粉（以下簡稱酶解組），以未經(jīng)酶解處理的高蛋白核桃粉和經(jīng)糊化但未液化糖化的苦蕎-藜麥復(fù)合粉為對照（以下簡稱未酶解組），進(jìn)行體外消化和抗氧化功能特性的對比研究。

1.3.7 核桃多肽-苦蕎-藜麥復(fù)合粉體外消化特性

模擬胃液消化過程：取1 g經(jīng)噴霧干燥后的復(fù)合粉于50 mL離心管中，加入20 mL pH 1.7的KCl-HCl緩沖溶液及800 U胃蛋白酶，37 ℃恒溫?cái)嚢柘? h，從開始模擬胃液消化時(shí)分別于1、2、3 h取樣滅酶，測定多肽、還原糖、黃酮和多酚含量。

模擬小腸液消化過程：在胃液消化過程基礎(chǔ)上，用1 mol/L NaHCO3溶液緩慢調(diào)節(jié)pH值至6.8，加入40 mL pH 6.8的KH2PO4-NaOH緩沖溶液及800 U胰蛋白酶、12 000 U葡萄糖苷淀粉酶、12 000 U豬胰腺α-淀粉酶，37 ℃恒溫?cái)嚢柘? h。分別于4、5、6、7 h取樣滅酶，測定多肽、還原糖、黃酮和多酚含量[23-24]。

根據(jù)淀粉成分劃分等級可以計(jì)算樣品不同類型淀粉含量，模擬小腸液消化過程測定還原糖含量時(shí)，酶水解20 min和120 min后取出測定葡萄糖含量，快消化淀粉（rapid digestible starch，RDS）、慢消化淀粉（slow digestible starch，SDS）及抗性淀粉（resistant starch，RS）質(zhì)量分?jǐn)?shù)[25]按公式（5）～（7）計(jì)算：

式中：G20為淀粉酶水解20 min后產(chǎn)生的葡萄糖質(zhì)量/mg；G120為淀粉酶水解120 min后產(chǎn)生的葡萄糖質(zhì)量/mg；FG為酶水解處理前淀粉中游離葡萄糖質(zhì)量/mg；TS為樣品總淀粉質(zhì)量/mg。

1.3.8 核桃多肽-苦蕎-藜麥復(fù)合粉體外抗氧化特性的測定

參考文獻(xiàn)[26]的方法對核桃多肽-苦蕎-藜麥復(fù)合粉進(jìn)行還原力、DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、O2-·清除率以及總抗氧化能力的測定與分析，并通過計(jì)算半數(shù)清除率（IC50值）比較酶解組和未酶解組抗氧化能力的強(qiáng)弱。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Origin 6.0軟件進(jìn)行分析作圖，各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，以 ±s表示，方差分析用Minitab 15數(shù)學(xué)分析軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃多肽-苦蕎-藜麥復(fù)合粉最佳復(fù)配比的確定

表3 原料蛋白中必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)）及SRCAATable3 Essential amino acid contents and SRCAA of amino acids in raw materials%

圖1 核桃、苦蕎和藜麥混合蛋白不同比例的SRCAAFig.1 SRCAA of mixed protein of walnut, buckwheat and quinoa in different proportions

原料蛋白及苦蕎-藜麥混合谷物蛋白SRCAA的變化規(guī)律如表3、圖1A所示，SRCAA隨苦蕎蛋白添加量增大而先增大后減小，苦蕎蛋白添加量為70%，也即苦蕎蛋白-藜麥蛋白質(zhì)量比為7∶3時(shí)，SRCAA值最高，為93.69%，因此確定苦蕎蛋白和藜麥蛋白的復(fù)配比為7∶3，實(shí)驗(yàn)中苦蕎粉蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.61%，藜麥粉蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14.27%，通過折算，確定苦蕎粉和藜麥粉的質(zhì)量比為13∶5，根據(jù)此比例進(jìn)行糊化液化糖化工藝優(yōu)化試驗(yàn)。

在確定苦蕎蛋白和藜麥蛋白最適復(fù)配比的基礎(chǔ)上，不同核桃蛋白添加量下SRCAA的變化規(guī)律如圖1B所示，當(dāng)核桃蛋白添加量為20%，也即核桃蛋白-苦蕎蛋白-藜麥蛋白質(zhì)量比為2.5∶7∶3時(shí)，SRCAA值達(dá)到了95.15%，超過了單一原料蛋白和苦蕎-藜麥復(fù)合蛋白的SRCAA值，表明氨基酸復(fù)配更接近參考蛋白模式，實(shí)驗(yàn)中核桃多肽粉蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為91.25%，根據(jù)苦蕎粉和藜麥粉的蛋白含量，通過折算，最終確定核桃多肽粉-苦蕎粉-藜麥粉質(zhì)量比為0.7∶13∶5。

2.2 苦蕎-藜麥復(fù)配谷物最佳液化條件的確定

2.2.1 液化單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖2 液化單因素試驗(yàn)對還原糖質(zhì)量濃度的影響Fig.2 Effect of three liquefaction conditions on the concentration of reducing sugar

如圖2A所示，當(dāng)酶添加量為7 U/g時(shí)液化效果最好，繼續(xù)增加酶添加量并不能提高溶液中還原糖質(zhì)量濃度，故選擇最適α-淀粉酶添加量為7 U/g。由圖2B可知，在60 ℃以下時(shí)液化效果隨溫度升高而增大，酶活性充分釋放，超過60 ℃液化效果開始下降，高溫使酶失活，故選擇最適液化溫度為60 ℃。圖2C反映了不同時(shí)間液化效果，還原糖質(zhì)量濃度隨時(shí)間延長而呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)超過40 min時(shí)，還原糖質(zhì)量濃度不再有明顯變化，故選擇最適液化時(shí)間為40 min。

2.2.2 液化正交試驗(yàn)結(jié)果

如表4所示，影響α-淀粉酶液化條件的主次因素分別為溫度＞時(shí)間＞α-淀粉酶添加量，液化后還原糖質(zhì)量濃度最高的組合為試驗(yàn)5（A2B2C3），即α-淀粉酶添加量7 U/g、溫度60 ℃、時(shí)間50 min，此時(shí)還原糖質(zhì)量濃度為6.81 mg/mL，結(jié)合表5可知，液化溫度對于還原糖質(zhì)量濃度的影響顯著（P＜0.05）、α-淀粉酶添加量和液化時(shí)間兩因素對還原糖質(zhì)量濃度的影響不顯著（P＞0.05）。

表4 苦蕎-藜麥復(fù)配谷物液化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table4 Orthogonal array design with experimental results for optimization of liquefaction

表5 液化正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table5 Analysis of variance for the effect of liquefaction conditions on reducing sugar concentration

2.3 苦蕎-藜麥復(fù)配谷物最佳糖化條件的確定

2.3.1 糖化單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖3 糖化3因素對還原糖質(zhì)量濃度的影響Fig.3 Effect of three saccharif i cation conditions on th concentration of reducing sugar

圖3 A反映了不同β-淀粉酶添加量的糖化效果，當(dāng)加酶量達(dá)到150 U/g時(shí)，糖化效果基本達(dá)到飽和，加大加酶量曲線趨于平緩，故選擇最適β-淀粉酶添加量為150 U/g。由圖3B可得，β-淀粉酶的活性隨溫度升高而逐漸釋放，超過60 ℃酶開始失活，影響糖化效果，故選擇最適糖化溫度為60 ℃。不同時(shí)間糖化效果如圖3C所示，還原糖質(zhì)量濃度隨時(shí)間延長而逐漸增大，當(dāng)時(shí)間達(dá)到2.5 h時(shí)酶解基本完成，故選擇最適糖化時(shí)間為2.5 h。

2.3.2 糖化正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 苦蕎-藜麥復(fù)配谷物糖化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table6 Orthogonal array design with experimental results for optimization of saccharif i cation

如表6所示，影響β-淀粉酶糖化條件的主次因素分別為溫度＞時(shí)間＞β-淀粉酶添加量，糖化后還原糖質(zhì)量濃度最高的組合為試驗(yàn)4（A2B1C2），即β-淀粉酶添加量150 U/g、溫度55 ℃、時(shí)間2.5 h，此時(shí)還原糖質(zhì)量濃度為20.03 mg/mL，結(jié)合表7可知，β-淀粉酶添加量、溫度和時(shí)間3 個因素均對還原糖質(zhì)量濃度的影響顯著（P＜0.05）。

表7 糖化正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table7 Analysis of variance for the effect of saccharif i cation conditions on reducing sugar concentration

2.4 體外消化結(jié)果

圖4 模擬消化過程中多肽（A）、還原糖（B）、黃酮（C）和多酚（D）含量的變化Fig.4 Changes in peptide (A), reducing sugar (B), fl avonoid (C) and polyphenol (D) contents following simulated digestion

圖4 A反映了酶解組和未酶解組在體外模擬消化過程中多肽含量的變化趨勢，核桃多肽-苦蕎-藜麥復(fù)合粉（酶解組）在經(jīng)過胃液和小腸液的消化后，蛋白質(zhì)充分水解，使得多肽含量隨消化時(shí)間延長而增加，消化效果比未酶解組好。體外模擬消化過程中還原糖含量的變化如圖4B所示，無論是酶解組還是未酶解組，復(fù)合粉經(jīng)過小腸液消化（3～7 h）后的還原糖含量比胃液（0～3 h）高，且在小腸液消化過程中，酶解組RDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為64.19%，未酶解組RDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為41.31%，表明酶解組消化更迅速，更易于人體消化吸收，酶解組SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27.12%，RS質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅有8.70%，未酶解組SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.26%，RS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為38.42%，酶解組中RS含量小于未酶解組，表明酶解組復(fù)合粉淀粉較未酶解組經(jīng)過胃腸消化后水解更徹底，更適合于低血糖人群食用。由圖4C和圖4D可得，酶解組和未酶解組復(fù)合粉經(jīng)過消化后黃酮和多酚含量均提高，且經(jīng)過小腸液消化后的含量稍高于胃液，在小腸液消化過程中黃酮含量隨時(shí)間延長而緩慢增加，多酚含量隨時(shí)間變化趨于平衡，表明復(fù)合粉在體外模擬消化過程中可能會因?yàn)槊傅南尫乓恍S酮類和多酚類物質(zhì)，且黃酮在小腸液中隨時(shí)間延長而緩慢釋放，多酚在消化時(shí)釋放較快[24]。

2.5 體外抗氧化結(jié)果分析

2.5.1 還原力分析

圖5 不同質(zhì)量濃度復(fù)合粉的還原力Fig.5 Reducing power of native and hydrolyzed composite powders

表8 不同質(zhì)量濃度復(fù)合粉還原力分析Table8 Determination of reducing power of native and hydrolyzed composite powders

抗氧化劑通過將電子提供給自由基而獲得一個質(zhì)子從而使自由基變?yōu)榉€(wěn)定分子，還原力越強(qiáng)抗氧化性越強(qiáng)[27]。因此可以通過測定物質(zhì)還原力反映抗氧化活性大小。樣品還原性物質(zhì)可將Fe3+還原成Fe2+，供電子數(shù)越多，還原出的Fe2+越多，形成普魯士藍(lán)化合物，反應(yīng)體系顏色由黃色變成藍(lán)色，700 nm波長處有特征吸收峰，測定吸光度可得知其還原力強(qiáng)弱[26]。圖5反映了吸光度隨復(fù)合粉質(zhì)量濃度的變化趨勢，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，酶解組和未酶解組吸光度均隨質(zhì)量濃度增大而增大，以復(fù)合粉質(zhì)量濃度為x，吸光度為y進(jìn)行線性擬合得到還原力線性回歸方程如表8所示，通過IC50值的對比，可以得出酶解組復(fù)合粉的還原力高于未酶解組。

2.5.2 DPPH自由基清除能力分析

DPPH自由基是一種在乙醇溶液中呈現(xiàn)深紫色且最大吸收波長為517 nm的有機(jī)氮自由基。抗氧化物能和DPPH自由基的電子成對從而使波長吸收慢慢消失，溶液逐漸褪色且褪色程度和所接受電子數(shù)呈現(xiàn)一種線性關(guān)系，吸光度越低則表明樣品對于DPPH自由基的清除能力越強(qiáng)[27]。由圖6可得，酶解組和未酶解組復(fù)合粉DPPH自由基清除率均隨質(zhì)量濃度增加而增大，且有良好的量效關(guān)系，以復(fù)合粉質(zhì)量濃度為x，DPPH自由基清除率為y得出DPPH自由基清除率的線性回歸方程如表9所示，通過IC50值的計(jì)算，得出酶解組對DPPH自由基的清除能力強(qiáng)于未酶解組。

圖6 不同復(fù)合粉對DPPH自由基的清除率Fig.6 DPPH radical scavenging capacity of native and hydrolyzed composite powders

表9 不同復(fù)合粉DPPH自由基的清除能力分析Table9 Determination of DPPH radical scavenging capacity of native and hydrolyzed composite powders

2.5.3 羥自由基清除能力分析

圖7 不同復(fù)合粉對羥自由基的清除率Fig.7 Hydroxyl radical scavenging capacity of native and hydrolyzed composite powders

表10 不同復(fù)合粉羥自由基的清除能力分析Table10 Determination of hydroxyl radical scavenging capacity of native and hydrolyzed composite powders

羥自由基具有極強(qiáng)得電子能力，是生命代謝過程中所產(chǎn)生的毒性最大、進(jìn)攻性最強(qiáng)的分子，可導(dǎo)致機(jī)體組織脂質(zhì)過氧化，還能夠迅速引發(fā)各類疾病發(fā)生和機(jī)體衰老加速。羥自由基由H2O2和FeSO4反應(yīng)產(chǎn)生，可與水楊酸反應(yīng)生成有色物質(zhì)，在510 nm波長處有強(qiáng)吸收峰，在抗氧化物存在情況下能夠清除羥自由基，有色物質(zhì)生成就會減少，故可根據(jù)吸光度變化判斷抗氧化能力[28]。圖7反映了羥自由基清除率隨復(fù)合粉質(zhì)量濃度變化的趨勢，酶解組和未酶解組復(fù)合粉對羥自由基清除率均隨質(zhì)量濃度增加而增大，且清除能力較接近，酶解組隨質(zhì)量濃度變化趨勢比未酶解組快，以復(fù)合粉質(zhì)量濃度為x，羥自由基清除率為y進(jìn)行線性擬合得到線性回歸方程如表10所示，通過IC50值的計(jì)算得出酶解組羥自由基清除能力較強(qiáng)于未酶解組。

2.5.4·清除能力分析

鄰苯三酚在堿性條件能發(fā)生自氧化反應(yīng)，產(chǎn)生一定濃度O2-·和中間物，兩者反應(yīng)得到有色物質(zhì)，抗氧化物質(zhì)的存在可以抑制·的產(chǎn)生，因此可通過測定有色物質(zhì)生成量判斷對·的清除能力[29]。由圖8可得，酶解組和未酶解組對·清除能力隨復(fù)合粉質(zhì)量濃度增加而增大，且質(zhì)量濃度和清除率之間有明顯量效關(guān)系，以復(fù)合粉質(zhì)量濃度為x，·清除率為y得到線性回歸方程如表11所示，由IC50值的對比可以看出酶解組對·清除能力高于未酶解組，具有良好的抗氧化活性。

圖8 不同復(fù)合粉對·的清除率Fig.8 · scavenging capacity of different composite powders

表11 不同復(fù)合粉·的清除能力分析Table11 Determination of · scavenging capacity of different composite powders

表11 不同復(fù)合粉·的清除能力分析Table11 Determination of · scavenging capacity of different composite powders

樣品 線性回歸方程 回歸系數(shù)R2 IC50/（mg/mL）酶解組 y=3.485 4x+4.449 0.997 8 13.07未酶解組 y=2.182 3x+16.708 0.998 9 15.26

2.5.5 總抗氧化能力分析

按照試劑盒方法對不同復(fù)合粉進(jìn)行總抗氧化能力的測定，保證酶解組和未酶解組復(fù)合粉質(zhì)量濃度均為20 mg/mL，相對于未酶解組的總抗氧化能力（18.13 U/mL）來說，酶解組總抗氧化能力（27.63 U/mL）提高了9.50 U/mL。未酶解組中核桃、苦蕎和藜麥本身就含有黃酮、多酚、低聚糖等活性成分，具備一定的抗氧化功能，酶解組中核桃多肽相對于核桃蛋白來說屬于小分子活性成分，苦蕎和藜麥淀粉經(jīng)酶解后水解成各種小分子糖，因而酶解組較未酶解組可能會暴露更多的抗氧化基團(tuán)[28-30]，從而提高抗氧化能力。

3 結(jié) 論

根據(jù)必需氨基酸參考模式，通過SRCAA計(jì)算方法評價(jià)了核桃多肽、苦蕎和藜麥的營養(yǎng)價(jià)值，確定了核桃多肽-苦蕎-藜麥粉最佳復(fù)配比為0.7∶13∶5，此時(shí)SRCAA值為95.15%。在此基礎(chǔ)上以還原糖質(zhì)量濃度為指標(biāo)，通過單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定了最佳液化條件為α-淀粉酶添加量7 U/g、溫度60 ℃、時(shí)間50 min，最佳糖化條件為β-淀粉酶添加量150 U/g、溫度55 ℃、時(shí)間2.5 h，此時(shí)還原糖質(zhì)量濃度為20.03 mg/mL。

體外模擬消化過程中酶解組蛋白質(zhì)充分水解，使得多肽含量隨消化時(shí)間延長而提高；無論是酶解組還是未酶解組經(jīng)過小腸液消化后還原糖含量均高于胃液，而且酶解組RDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為64.19%，未酶解組RDS為41.31%，表明酶解組消化更迅速，更易于人體吸收，酶解組SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27.12%，RS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.70%，未酶解組SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.26%，RS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為38.42%，酶解組中RS含量小于未酶解組，說明淀粉經(jīng)過胃腸消化后水解更徹底；黃酮和多酚經(jīng)過體外模擬消化后含量均增加。核桃多肽-苦蕎-藜麥復(fù)合粉經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明具備一定的消化特性，富含小分子肽、糖等營養(yǎng)物質(zhì)，更易于人體消化吸收。

體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)酶解組和未酶解組均表現(xiàn)出一定的還原能力、DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力、·清除能力以及總抗氧化能力，通過IC50值的比較可以發(fā)現(xiàn)，相對于未酶解組的還原力（IC50=6.76 mg/mL）、DPPH自由基清除能力（IC50=0.85 mg/mL）、羥自由基清除能力（IC50=69.31 mg/mL）、·清除能力（IC50=15.26 mg/mL）和總抗氧化能力（18.13 U/mL）來看，酶解組的還原力（IC50=5.04 mg/mL）、DPPH自由基清除能力（IC50=0.67 mg/mL）、羥自由基清除能力（I C50=6 2.3 2 m g/m L）、·清除能力（I C50=1 3.0 7 m g/m L）和總抗氧化能力（27.63 U/mL）均有了一定的提高。本實(shí)驗(yàn)研制出的核桃多肽-苦蕎-藜麥復(fù)合粉營養(yǎng)搭配合理，易于消化吸收且具有一定抗氧化活性，為今后相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供了一定的理論指導(dǎo)和參考價(jià)值。

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