李 晶，倪朝敏，陳建華，米其利，孔維松，王曉輝，楊光宇，李雪梅，楊葉昆*

（云南中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，云南 昆明 650106）

香精香料是重要的添加劑，與食品安全休戚相關，因此對香精香料進行霉變監(jiān)控與預防具有重要的現實意義[1-3]。麥角甾醇和麥角甾酮是真菌細胞膜中的主要甾體類化合物，主要存在于絕大多數的真菌細胞膜中[4]，維系著真菌細胞的正常代謝[5-8]，據報道麥角甾醇的量與真菌的生物量存在著相關關系（麥角甾醇可作為評價糧食質量安全的敏感指標之一）；因其在大部分植物中不含有或含量很小，其良好的特異性和穩(wěn)定性使其可作為霉菌污染的標記物[9]，作為質量安全指標在世界范圍內得到了廣泛的研究與應用[10-13]。

目前，對麥角甾酮與麥角甾醇的定性與定量分析研究已經很多，主要報道的方法有毛細管電泳法[14]、高效液相色譜法[15-20]、液相色譜-質譜法[21-22]和氣相色譜-質譜法[23-27]等。由于香精香料基質復雜，有些樣品具有高水分高糖分的特點，單純利用液相色譜紫外檢測存在著定性困難的問題，而利用氣相色譜方法存在著前處理復雜的問題，高效液相色譜-串聯(lián)質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）在定性和定量方面都具有其優(yōu)點，目前香精香料中麥角甾酮和麥角甾醇同時測定的方法還鮮見報道。

基質固相分散前處理是近年來一種新的固相提取技術[28]，可以將提取凈化集于一體，已經被廣泛應用于基質復雜樣品的前處理，可以有效避免HPLC-MS/MS由于基體效應造成的信號影響[29]。本研究基于基質固相分散處理的原理，設計開發(fā)出一種新型的在線凈化前處理裝置，用于基質復雜的香精香料的前處理凈化，方法操作簡單，凈化萃取濃縮為一體，經過提取凈化后的樣品利用HPLC-MS/MS進行測定，可以應用于香精香料中麥角甾醇和麥角甾酮的監(jiān)控分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥角甾醇、麥角甾酮（純度≥99%） 加拿大Chromadex公司；膽甾烷醇酮-6-酮（純度＞99.0%） 百靈威科技有限公司；甲醇、乙腈、二氯甲烷（均為色譜純）美國Merk公司；球形硅膠（40～60 μm） 德國默克公司；硫酸鈉（分析純） 西隴化工有限公司；硫酸鈉于200 ℃烘烤6 h后，冷卻放入磨口塞玻璃瓶內，置于干燥器內備用；所有實驗用水均為去離子水（18.2 MΩ·cm），由Milli-Q超純水純化系統(tǒng)制得。

香精香料樣品為某香精香料生產企業(yè)提供，模擬霉變樣品為實驗室自制樣品，采用增加水分后在空氣相對濕度80%，溫度37 ℃條件下高溫高濕培養(yǎng)加速霉變，直至得到感官明顯能感覺到霉變的樣品。

1.2 儀器與設備

ACQUITY超高效液相色譜儀 美國Waters公司；API4000QTRAP質譜儀 美國應用生物系統(tǒng)公司；Milli-Q50超純水儀 美國Millipore公司；BT224S電子天平（感量0.1 mg） 德國Sartorius公司；SK5200型超聲波振蕩器 上?？茖С晝x器有限公司；0.45 μm有機針式過濾器 上海安譜科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

標準溶液：分別準確稱取5.0 mg（精確至0.1 mg）的麥角甾醇和麥角甾酮于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成質量濃度均為0.5 mg/mL的標準儲備液，使用時用甲醇稀釋成所需質量濃度的標準工作液。

內標溶液：稱取5.0 mg的膽甾烷醇酮-6-酮至10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成質量濃度為0.5 mg/mL的內標儲備液；使用時稀釋成50 μg/mL的內標工作液。

1.3.2 HPLC-MS/MS條件

色譜條件：色譜柱：ACQUITY UPLCTMBEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量5 μL；流動相：A為水，B為HPLC級甲醇；流動相梯度洗脫程序：0.0～6.0 min，95% B遞增至100% B；6.0～7.5 min保持100% B；8.0 min還原為初始狀態(tài)95% B。

質譜條件：電離方式：大氣壓化學電離源；正離子模式掃描；多反應監(jiān)測模式；電噴霧電壓5 500 V；離子源溫度650 ℃；離子對的駐留監(jiān)測時間100 ms；輔助氣Gas1壓力60 psi；輔助氣Gas2壓力70 psi；各分析物的質譜檢測參數見表1。

表1 化合物質譜檢測參數Table1 MS parameters of the analytes

1.3.3 樣品前處理

本研究設計了一個基于固相分散萃取和硅膠柱層析的新型在線凈化裝置，如圖1所示。裝置以索式提取裝置為基礎，進行了提取凈化固相試劑的裝填，以及方便進行溶劑回收的三通閥和用于定量濃縮的有刻度的尾管設計。

圖1 樣品前處理裝置的結構圖Fig.1 Schematic of the sample preparation apparatus

處理步驟如下：1）準確稱取香精或料液樣品1.0 g，加入質量濃度為50 μg/mL的內標工作液200 μL，然后加入2.0 g的硅膠和樣品充分研磨均勻；2）在樣品前處理裝置中的填料管中加入一個篩板以防止硅膠滑落，先加入10 g硅膠，微微振動，使硅膠在篩板上形成一層，然后將樣品硅膠加入填料管，稍微振動，使之填充嚴實，形成樣品硅膠層；之后再在樣品硅膠層鋪2.5 g無水硫酸鈉，同樣振動，使之裝填嚴實平整。3）將裝填好的填料管連接上索式提取器，在燒瓶中加入60 mL二氯甲烷，三通閥調整為填料管連接燒瓶狀態(tài)，水浴60 ℃條件下加熱回流提取樣品45 min。4）樣品提取完后，三通閥調整為提取管與溶劑回收口相通狀態(tài)，使溶劑從回收口流出，回收溶劑并濃縮樣品直至燒瓶尾管中的樣品溶液濃縮盡干；5）向尾管中加入1 mL乙腈溶解殘余物，溶液用0.45 μm濾膜過濾后，按選定儀器條件測定麥角甾醇和麥角甾酮含量。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件

2.1.1 樣品前處理裝置

對于麥角甾醇和麥角甾酮的測定，樣品前處理一般分為樣品提取、固相萃取（或柱層析）凈化、濃縮三步；采用的方法多為樣品用溶劑提取，然后用硅膠固相萃取柱（或反相固相萃取）凈化，再供儀器分析用。為簡化操作，本研究設計了一個帶柱層析功能的索氏提取裝置（圖1），裝置由普通索式提取裝置改裝而來（球形燒瓶500 mL，抽出筒直徑40 mm，抽出筒長190 mm），對抽出筒下端進行改裝，加入了1 個三通閥進行溶劑的冷凝或者回收。樣品利用硅膠進行基質分散，裝填好篩板、硅膠層、樣品硅膠層和無水硫酸鈉層，將三通閥調整到提取管與圓底燒瓶相通的狀態(tài)，啟動水浴鍋加熱，溶劑蒸發(fā)后再經冷凝管回流冷凝到填料管中；溶劑把樣品中的麥角甾醇和麥角甾酮洗脫下來，通過硅膠層進行凈化，部分極性雜質被凈化；回流后的樣品溶液經無水硫酸鈉層干燥，以便于溶劑回流和冷凝，經過一段時間的回流提取，樣品中的麥角甾醇和麥角甾酮被完全提取并轉移到圓底燒瓶內；然后轉換三通閥，讓溶劑從溶劑回收出口流出，這樣圓底燒瓶中的溶液不斷被濃縮，當溶劑濃縮到干后，換成反相色譜分析常用溶劑乙腈進行殘余樣品的溶解，即可供液相色譜分析用。

2.1.2 前處理溶劑選擇

本研究中樣品前處理的關鍵步驟是硅膠固相萃取凈化，溶劑的選擇非常重要，溶劑對硅膠柱的洗脫強度適當才能讓麥角甾醇和麥角甾酮從硅膠柱上洗脫，并讓雜質更多地保留在柱上，從而達到樣品凈化的目的。硅膠為極性固定相，選擇適當的溶劑洗脫可讓麥角甾醇和麥角甾酮與樣品中的共存組分分離而達到樣品凈化。由于麥角甾醇和麥角甾酮均為小極性化合物，用溶劑強度相對弱的溶劑洗脫可把待測成分完全洗脫下來，而香精香料中的糖類、有機酸、酯類、醇類、醛、酮等中大極性的干擾成分大部分保留在硅膠柱，這樣可達到樣品凈化的效果。通過實驗石油醚、環(huán)己烷、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷對樣品的凈化效果，結果表明石油醚、環(huán)己烷、正己烷溶劑洗脫強度較弱，麥角甾醇和麥角甾酮不能被完全洗脫，回收率低于50%；二氯甲烷和三氯甲烷具有較強的洗脫能力，麥角甾醇和麥角甾酮回收率均在90%以上；實驗發(fā)現，如果換成極性更大的乙酸乙酯或丙酮作為洗脫溶劑，麥角甾醇和麥角甾酮也能被完全洗脫，但由于洗脫下來的雜質成分也相應增加，樣品濃縮時容易出現沉淀或變渾濁，影響樣品的凈化效果?？紤]到二氯甲烷毒性比三氯甲烷低，而且沸點低，容易實現回流，因此，本實驗中選擇二氯甲烷作為前處理中的溶劑。

2.1.3 前處理溶劑體積優(yōu)化

在提取實驗中，需在提取裝置中加入足夠量的溶劑，以保持溶劑在前處理過程中能回流循環(huán)；本實驗中采用體積為50 mL的提取管，實驗表明，當提取裝置中的溶劑量達40 mL時能保持正常回流循環(huán)，溶劑加入量在50～80 mL之間待測組分的回收率均穩(wěn)定，均在90%以上，繼續(xù)增加溶劑量對待測組分的回收率沒有影響，但會導致樣品前處理的溶劑消耗增加?？紤]到在樣品前處理過程中溶劑因蒸發(fā)而有少量損失，因此選擇在提取器中加入60 mL的二氯甲烷溶劑。

2.1.4 前處理溫度優(yōu)化

本實驗進行不同前處理溫度回收率的優(yōu)化實驗發(fā)現，二氯甲烷沸點僅為39.8 ℃，當水浴溫度超過45 ℃時，尾管燒瓶中的溶劑開始沸騰，隨溫度升高，溶劑蒸發(fā)速度迅速加快，當溫度達到55～65 ℃時溶劑蒸發(fā)速率能達到5 mL/min左右（稍大于提取管內柱層析上的流下速度）。如果溫度低于55 ℃，溶劑蒸發(fā)慢，需延長樣品處理時間。由于洗脫流速受硅膠柱的控制，進一步升高溫度雖然會增加溶劑的蒸發(fā)速率，但過量的溶劑會從導氣管分流出，不能加快洗脫速率；而且溫度過高會增加提取過程中的溶劑損失，增加樣品前處理過程中的溶劑消耗并污染實驗室環(huán)境；因此，實驗優(yōu)化選擇水浴溫度為60 ℃。

2.1.5 前處理提取時間優(yōu)化

圖2 提取時間對回收率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the recovery

選取經硅膠基質分散的樣品，在60 ℃的水浴中進行回流提取，考察提取時間對麥角甾醇和麥角甾酮測定結果的影響。比較了提取時間分別為20、25、30、35、40、45、50、60 min的測定結果，如圖2所示。結果表明：提取時間在40 min以后麥角甾醇和麥角甾酮萃取效率達到一個穩(wěn)定值，測定結果趨于穩(wěn)定，進一步延長提取時間則會導致更多的雜質洗脫下來而影響樣品的凈化效果；為節(jié)約時間并避免引入更多的干擾成分，本實驗選擇45 min作為樣品提取的最佳時間。

2.2 HPLC-MS/MS分析條件優(yōu)化

通過查閱文獻，膽甾烷醇酮-6-酮可用作HPLC-MS/MS測定甾醇的內標物[30]，由于它們的化學性質基本相同，可以最大限度地減少因為樣品損失造成的分析誤差，提高結果的準確性；而且膽甾烷醇酮-6-酮不是香精香料中的固有成分，其保留時間和待測組分不重疊，故本實驗中選擇膽甾烷醇酮-6-酮作為內標物質。

在固定其他條件不變，本研究中優(yōu)化選用大氣壓化學電離源為離子源，[M+H]+是信號比較強的離子碎片，其子離子掃描圖見圖3。因此本實驗選擇正離子掃描模式。

由于在大氣壓化學電離模式下，乙酸銨、乙酸等電噴霧要求較低的揮發(fā)性緩沖鹽會抑制麥角甾醇等甾體類化合物的有效電離，使其響應信號降低，故優(yōu)選甲醇-水體系作為流動相，選擇5 μL進樣量，色譜柱溫度為40 ℃。

圖3 麥角甾醇（a）和麥角甾酮的二級質譜圖（b）Fig.3 Tandem mass spectra of the analytes

2.3 方法評價

2.3.1 方法線性關系、檢出限和定量限結果

圖4 標準溶液色譜圖Fig.4 MRM chromatograms of standards

以甲醇作為溶劑，配制一系列標準溶液，采用實驗優(yōu)化的方法進行分析檢測，待測物質能在5 min內進行有效分離，標準樣品色譜圖如圖4所示。采用內標法得到的麥角甾醇和麥角甾酮的線性關系，檢出限和定量限見表2。其中檢出限和定量限分別取最低質量濃度標準溶液連續(xù)10 次進樣，計算測定結果的標準偏差，由3 倍和10 倍的標準偏差得到。

表2 麥角甾醇、麥角甾酮的線性關系、檢出限和定量限Table2 Linear regression equations, correlation coeff i cients, limits of detection and quantif i cation for the analytes

以目標物質的色譜峰面積Y對其質量濃度X（μg/mL）進行線性回歸。從表2可以看出，目標檢測物質在1.5～250 μg/mL范圍內線性關系良好，相關系數大于0.999，麥角甾醇定量限為0.98 μg/mL，麥角甾酮定量限為1.16 μg/mL。

2.3.2 重復性考察結果

為考察方法的精密度，對5 種不同類型的模擬霉變香精香料進行7 次日內重復測定，結果表明，麥角甾醇的相對標準偏差在2.8%～3.2%之間，麥角甾酮的相對標準偏差在2.9%～3.4%之間，日內測定結果方法的日內精密度較好。采用所建立的檢測方法對5 種類型樣品進行了7 d的重復實驗，結果表明，麥角甾醇的相對標準偏差在3.1%～3.6%之間，麥角甾酮的相對標準偏差在3.3%～3.5%之間，方法的日間精密度較好。

2.3.3 方法的回收率結果

選取了5 種不同類型的模擬霉變香精香料，分別進行了高（20 μg）、中（10 μg）、低（5 μg）3 個水平的加標回收率實驗，麥角甾醇的回收率在91%～96%之間，麥角甾酮的回收率在86%～93%之間，方法回收率較為理想，可以應用于實際樣品的分析測定。

2.4 實際樣品分析

圖5 實際樣品色譜圖Fig.5 MRM chromatograms of real sample

表3 12 種香精香料中目標物質含量的測定Table3 Contents of the target compounds in 12 real samples μg/g

用所建方法對12 種香精香料樣品進行前處理，并用優(yōu)化的方法測定樣品中麥角甾醇和麥角甾酮含量，圖5為某模擬霉變香料樣品的MRM色譜，分析結果見表3。其中1、2、7～9為人工加速霉變的模擬樣品（處理方法如2.1節(jié)），并用文獻[21]的方法對測定結果進行驗證，結果表明，本方法的分析結果和對照方法相符合，測定結果準確。

結果表明，除5 種人工模擬加速霉變的樣品外，其他企業(yè)在用的香精香料樣品中麥角甾醇和麥角甾酮含量均低于檢測限，說明企業(yè)在用香精香料中暫時沒有發(fā)現霉變風險，而本方法可以有效監(jiān)控和檢測到香精香料樣品的霉變情況。

3 結 論

本實驗以麥角甾醇和麥角甾酮為霉變標志物，建立了一種新型在線凈化前處理HPLC-MS/MS測定香精香料中的麥角甾醇和麥角甾酮的方法，用于香精香料樣品霉變情況監(jiān)控的篩查。方法結合基質分散萃取，柱層析以及索式提取創(chuàng)新性的開發(fā)設計了一個在線凈化前處理裝置，集萃取、凈化和濃縮為一體，具有前處理簡便易操作，穩(wěn)定性強，溶劑可回收等優(yōu)點，方法優(yōu)化了液相色譜和質譜的各個參數，采用內標法可以快速、有效地對香精香料中的麥角甾醇和麥角甾酮進行測定，該方法已經應用于實際樣品的測定，可以對香精香料的安全風險進行有效防控，具有重要應用價值和現實意義。

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