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        高效液相色譜法評價海洋生物中半胱氨酸雙加氧酶活性

        2018-06-26 09:05:26范子瑞胡佳妃江瑞妮楊星玲金火喜
        食品科學(xué) 2018年12期
        關(guān)鍵詞:加氧酶乙酸鈉牛磺酸

        范子瑞,胡佳妃,江瑞妮,楊星玲,金火喜*

        (浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院,浙江 舟山 316022)

        ?;撬嵊址Q牛膽酸,是一種含硫的非蛋白氨基酸,在體內(nèi)以游離狀態(tài)存在,具有廣泛的生理功能,如促進(jìn)嬰幼兒腦組織和智力發(fā)育、增強人體免疫、增強細(xì)胞抗氧化能力等[1-8],在臨床上已被廣泛應(yīng)用于心血管疾病、糖尿病、眼部疾病等一系列疾病的治療[9-11]。?;撬岬姆植际謴V泛,哺乳動物的主要臟器,如:心臟、腦、肝臟中含量較高[12-14];海洋生物,特別是海魚、貝類,如墨魚、牡蠣、海螺、蛤蜊等?;撬岷孔顬樨S富[15-18]。

        生物體內(nèi)?;撬岬纳锖铣赏緩捷^為復(fù)雜,其中通過半胱氨酸雙加氧酶催化半胱氨酸形成半胱亞磺酸,再經(jīng)半胱亞磺酸脫羧酶催化脫羧生成亞?;撬幔詈笱趸膳;撬崾亲钪饕耐緩絒19-23]。相比于哺乳動物,雖然海洋生物體內(nèi)?;撬岷糠浅XS富,但對其合成途徑中的關(guān)鍵酶(半胱氨酸雙加氧酶和半胱亞磺酸脫羧酶)的研究則鮮有文獻(xiàn)報道。據(jù)此,本研究以?;撬嶂饕緩街械陌腚装彼犭p加氧酶為對象,通過建立快速靈敏的分析方法來評價不同種類海洋生物體內(nèi)半胱氨酸雙加氧酶的活性。目前,對海洋生物體內(nèi)半胱氨酸雙加氧酶活性進(jìn)行廣泛的檢測和篩選等相關(guān)工作在國內(nèi)尚屬空白。本研究的結(jié)果可為后續(xù)進(jìn)一步明確海洋生物體內(nèi)?;撬岬暮铣赏緩教峁﹨⒖家罁?jù)。

        向從海洋生物組織樣品中提取的初酶液中加入底物半胱氨酸,適宜條件下反應(yīng),通過檢測反應(yīng)液中產(chǎn)物半胱亞磺酸的含量可定量分析樣品中半胱氨酸雙加氧酶的活性。高效液相色譜法檢測氨基酸的含量,常常采用柱前衍生法,主要有異硫氰酸苯酯衍生法、單磺酰氯衍生法[24]、鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde,OPA)衍生法[25-28]等。異硫氰酸苯酯衍生氨基酸需要專門的衍生裝置和無水環(huán)境,有毒且易于降低柱壽,單磺酰氯試劑價格又相對昂貴,OPA衍生法則安全簡便。本實驗采用OPA為衍生劑,甲醇-乙酸鈉為流動相,擬建立峰形良好、快速準(zhǔn)確的半胱亞磺酸含量檢測方法,利用該方法分析不同海洋生物中半胱氨酸雙加氧酶的活性。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        白瓜子、貽貝和白蛤等海洋生物購于舟山市樂購超市。

        半胱氨酸、半胱亞磺酸、OPA、甲醇、硼酸、氫氧化鈉、乙酸鈉、乙硫醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫化鈉 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        1200高效液相色譜儀 美國Agilent公司;Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)、SHZ-88A水浴恒溫振蕩器 蘇州市培英實驗設(shè)備有限公司;FS-1高速勻漿機 江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠。

        1.3 方法

        1.3.1 溶液的配制

        0.4 mol/L硼酸鈉緩沖液配制:稱取2.48 g硼酸和1.41 g氫氧化鈉,用蒸餾水定容至100 mL。衍生試劑配制:用1 mL甲醇溶解0.01 g的OPA,再加入0.01 mL乙硫醇,用0.4 mol/L的硼酸鈉緩沖液定容至10 mL,在冰箱中密封避光保存。pH 7.4磷酸緩沖溶液配制:準(zhǔn)確稱取磷酸氫二鈉0.081 mol,磷酸二氫鈉0.019 mol,定容至500 mL。半胱亞磺酸標(biāo)準(zhǔn)液(1 mg/mL)配制:準(zhǔn)確稱取0.05 g半胱亞磺酸,用pH 7.4磷酸緩沖液定容至50 mL。

        1.3.2 半胱亞磺酸分析方法建立

        吸取半胱亞磺酸標(biāo)樣250 μL于1.5 mL離心管中,加入一定量的衍生劑,搖勻,在37 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)反應(yīng),經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾,立刻進(jìn)樣20 μL,通過高效液相色譜進(jìn)行分析,記錄其峰面積及其保留時間。根據(jù)峰形、保留時間等指標(biāo)對檢測波長、衍生劑量、衍生時間、流動相比例、流速等條件進(jìn)行優(yōu)化。初始條件:色譜柱XDB-C18,甲醇-乙酸鈉(65∶35,V/V),半胱亞磺酸與衍生劑物質(zhì)的量比1∶2,流速1 mL/min,衍生時間2 min,波長315 nm。

        1.3.3 半胱亞磺酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

        將半胱亞磺酸標(biāo)準(zhǔn)液(1 mg/mL)用超純水依次稀釋成0.4、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01 mg/mL 6 個質(zhì)量濃度梯度。各取250 μL于1.5 mL離心管中,按照1.3.2節(jié)所述步驟,在最優(yōu)條件下對半胱亞磺酸質(zhì)量濃度進(jìn)行測定。以半胱亞磺酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        1.3.4 精密度實驗

        分別取0.01、0.1 mg/mL和0.4 mg/mL的半胱亞磺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照1.3.2節(jié)所述步驟,在最優(yōu)條件下對半胱亞磺酸質(zhì)量濃度進(jìn)行測定。每種質(zhì)量濃度平行測定5 次,記錄峰面積,并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

        1.3.5 樣品中半胱氨酸雙加氧酶活性檢測

        取20 g洗凈的海洋生物組織(肉、內(nèi)臟、鰓等),加入2.5 倍體積磷酸鹽緩沖液(0.02 mol/L,pH 7.4),在冷水循環(huán)控溫下,勻漿30 min后4 ℃、8 000 r/min離心20 min,去沉淀。上清液采用硫酸銨鹽析(飽和度70%,溫度4 ℃)4 h,10 000 r/min離心15 min,棄上清液。沉淀中加入50 mL磷酸鹽緩沖液(0.02 mol/L,pH 7.4),并置于同種緩沖液中透析12 h,中途更換一次緩沖液。實驗組取透析后的初酶液1 mL,加入0.05 mol/L半胱氨酸溶液1 mL,再加入0.05 mol/L硫化鈉溶液0.2 mL。另取初酶液1 mL,加入1 mL磷酸鹽緩沖液和0.2 mL 0.05 mol/L硫化鈉溶液,作為對照組。將實驗組和對照組均于37 ℃、120 r/min條件下反應(yīng)2 h。取250 μL反應(yīng)液于0.5 mL離心管內(nèi),按照1.3.2節(jié)方法檢測產(chǎn)物半胱亞磺酸的含量。在上述反應(yīng)條件下,每分鐘催化生成1 μg半胱亞磺酸所需的酶量定義為一個酶活單位(U)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 波長選擇

        以甲醇-乙酸鈉為流動相,在不同波長下對半胱亞磺酸衍生物進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖1所示。當(dāng)波長為280 nm時,半胱亞磺酸與相鄰峰未達(dá)到基線分離,分離效果差;當(dāng)波長為315 nm時,半胱亞磺酸衍生物有最大吸收峰,且與相鄰峰的分離得到改善,達(dá)到基線分離,保留時間為1.46 min;當(dāng)波長增加到360 nm時,又出現(xiàn)新的相鄰峰,難以與半胱亞磺酸峰完全分離;當(dāng)波長繼續(xù)提高到430 nm時,出現(xiàn)倒型峰,峰形極差。故選擇315 nm為后續(xù)半胱亞磺酸的檢測波長。

        圖1 不同波長下半胱亞磺酸色譜圖Fig.1 Chromatograms of cysteine sulf i nate at different wavelengths

        2.2 流動相比例選擇

        選用甲醇與0.05 mol/L的乙酸鈉作為流動相,分別選擇體積比30∶70、40∶60、50∶50、65∶35和80∶20進(jìn)行實驗。如表1所示,在不同的體積比下,半胱亞磺酸與相鄰峰均能達(dá)到基線分離,但保留時間隨著甲醇比例的增加而縮短,吸收峰面積則先減小后增大。在半胱亞磺酸質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL下,當(dāng)甲醇-乙酸鈉(30∶70,V/V)時,半胱亞磺酸保留時間為2.18 min,峰面積為1 284;當(dāng)甲醇-乙酸鈉(50∶50,V/V)時,半胱亞磺酸保留時間為1.47 min,峰面積為993;當(dāng)甲醇和乙酸鈉體積比提高到80∶20時,半胱亞磺酸保留時間為1.46 min,峰面積為1 361。以吸收峰面積(峰面積最大)及保留時間長短(保留時間最短)為評價指標(biāo),確定流動相:甲醇-乙酸鈉(80∶20,V/V)。

        表1 流動相比例對半胱亞磺酸檢測的影響Table1 Effect of mobile phase composition on detection of cysteine sulf i nate

        2.3 流動相流速選擇

        流動相流速太慢,目標(biāo)物質(zhì)保留時間延長,峰形變寬;流速太快則會導(dǎo)致目標(biāo)物質(zhì)尚未完全檢測,峰面積變小。本實驗選擇波長315 nm,甲醇-乙酸鈉(80∶20,V/V)為流動相,考察不同流速(0.8、1.0、1.5、1.8、2.0 mL/min)對半胱亞磺酸(0.1 mg/mL)檢測的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同流速下半胱亞磺酸均有良好的分離效果,但保留時間和峰面積均隨流速的增大而減?。ū?)。綜合考慮峰面積和保留時間,選擇1.0 mL/min為最終流動相的流速。

        表2 流動相流速對半胱亞磺酸檢測的影響Table2 Effect of mobile phase fl ow rate on detection of cysteine sulf i nate

        2.4 衍生劑用量的選擇

        衍生劑用量對半胱亞磺酸的檢測有一定影響,衍生劑太少,反應(yīng)不完全,峰面積較小;衍生劑太多則不僅會導(dǎo)致藥品的浪費,而且會影響峰形。本實驗分別選擇不同量的衍生劑(半胱亞磺酸和衍生劑物質(zhì)的量比為2∶1、1∶1、1∶2、1∶3),以峰面積和峰形為評價指標(biāo),確定衍生劑的最適用量。如圖2所示,隨著衍生劑用量的增加,半胱亞磺酸峰面積也逐漸增加,但當(dāng)衍生劑與底物物質(zhì)的量比超過2∶1時,繼續(xù)增加衍生劑用量峰面積不再增加,這說明衍生劑已經(jīng)過量。此外,衍生劑與底物物質(zhì)的量比達(dá)到3∶1時,半胱亞磺酸峰形較寬,且出現(xiàn)裂縫現(xiàn)象。所以,最終選擇底物半胱亞磺酸與衍生劑物質(zhì)的量比為1∶2。

        圖2 衍生劑用量對半胱亞磺酸峰面積的影響Fig.2 Effect of derivatizing agent on peak area of cysteine sulf i nate

        2.5 衍生時間的選擇

        半胱亞磺酸與衍生試劑反應(yīng)迅速,靈敏度高,但衍生產(chǎn)物并不穩(wěn)定,衍生時間過長,產(chǎn)物分解,峰面積減小。如圖3所示,隨著衍生時間的延長,峰面積從1 min時的1 305增加到3 min時的2 031。繼續(xù)延長衍生時間至5 min,峰面積下降至1 340,這說明衍生物已經(jīng)部分分解。所以,本實驗采用衍生時間為3 min。

        圖3 衍生時間對峰面積的影響Fig.3 Effect of derivatization time on peak area of cysteine sulf i nate

        2.6 半胱亞磺酸測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

        在上述最優(yōu)條件下,以半胱亞磺酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),制得半胱亞磺酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)半胱亞磺酸在10~400 μg/mL范圍時,半胱亞磺酸質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系,回歸方程y=17.92x-129.3,R2= 0.998。

        2.7 精密度實驗結(jié)果

        表3 精密度測試結(jié)果Table3 Results of precision test

        選擇3 個不同質(zhì)量濃度的半胱亞磺酸標(biāo)樣,分別為低質(zhì)量濃度(10 μg/mL)、中質(zhì)量濃度(100 μg/mL)和高質(zhì)量濃度(400 μg/mL),同一樣品重復(fù)測定5 次,峰面積見表3。此3 種質(zhì)量濃度的半胱亞磺酸標(biāo)樣相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為6.4%、3.3%和0.9%,說明該方法精密度較高,具有良好的重復(fù)性。

        2.8 樣品中半胱氨酸雙加氧酶的活性檢測結(jié)果

        本實驗選擇了幾種有代表性海洋生物,對其不同組織中胱氨酸雙加氧酶的活性進(jìn)行了檢測。取一定量海產(chǎn)品組織,經(jīng)洗凈、勻漿、鹽析和透析后得粗酶液。取粗酶液加入一定量的底物半胱氨酸,一定條件下反應(yīng)后檢測反應(yīng)液中半胱亞磺酸的含量(具體過程見1.3.5節(jié)),從而評價樣品中半胱氨酸雙加氧酶的活性。由圖4可知,樣品反應(yīng)液中半胱亞磺酸的檢測受到其他組分一定程度上的干擾,但總體上分離度尚可,后續(xù)實驗有待進(jìn)一步改進(jìn)。

        圖4 樣品反應(yīng)液色譜圖Fig.4 Chromatogram of cysteine sulfonate produced by crude cysteine dioxygenase

        通過對各組織樣品反應(yīng)液中半胱亞磺酸進(jìn)行檢測,并根據(jù)其質(zhì)量濃度計算半胱氨酸雙加氧酶活性,結(jié)果如表4所示。貝類、蝦類、蟹類和海洋魚類體內(nèi)均檢測到半胱氨酸雙加氧酶的活性,其中南美白對蝦體內(nèi)半胱氨酸雙加氧酶活性高達(dá)28.9 U。白蛤、蛤蜊和梭子蟹中半胱氨酸雙加氧酶活性也較高。對大黃魚、海鱸魚和美國紅魚不同組織中半胱氨酸雙加氧酶的活性進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同組織中半胱氨酸雙加氧酶的活性有顯著差異。一般來說,魚體內(nèi)臟,特別是肝臟中半胱氨酸雙加氧酶的活性明顯高于其他組織,而鰓中半胱氨酸雙加氧酶的活性則最低。此外,腸和肌肉組織中半胱氨酸雙加氧酶的活性也較高。

        表4 不同海洋生物組織中半胱氨酸雙加氧酶活性的測定Table4 Determination of cysteine dioxygenase activity in different marine organisms

        海洋生物是?;撬岬奶烊粚殠?,尤其是海洋貝類、甲殼類、魚類等,其體內(nèi)含有十分豐富的?;撬醄29]。據(jù)文獻(xiàn)[30]報道,牛磺酸在不同組織中的含量差異較大。一般來說,魚體內(nèi)臟,尤其是肝臟中?;撬岷枯^高,而鰓中則含量較少。本實驗結(jié)果顯示,在海洋生物的不同組織中,半胱氨酸雙加氧酶活性的大小與文獻(xiàn)報道的牛磺酸含量的分布相關(guān)聯(lián),表明半胱氨酸雙加氧酶是牛磺酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶,其活性的大小間接決定了牛磺酸含量的高低。所以,檢測海洋生物不同組織中半胱雙加氧酶的活性,可一定程度上評估其?;撬岬暮铣赡芰?。若再結(jié)合其他相關(guān)酶活性的檢測,可定性分析不同海洋生物體內(nèi)?;撬岬暮铣赏緩?,為揭示牛磺酸的合成機制提供一定的參考基礎(chǔ)。

        3 結(jié) 論

        本實驗建立了半胱亞磺酸的高效液相色譜分析方法。采用OPA柱前衍生法,檢測波長315 nm,以甲醇-乙酸鈉(8∶2,V/V)為流動相,流速為1 mL/min,半胱亞磺酸與衍生試劑物質(zhì)的量比為1∶2,衍生時間3 min,半胱亞磺酸出峰時間為1.46 min。該方法在10~400 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(R2>0.99),相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%~6.4%。利用該方法檢測不同海產(chǎn)品組織中半胱氨酸雙加氧酶的活性。檢測結(jié)果表明,不同的海洋生物中半胱氨酸雙加氧酶活性差異較大,其中南美白對蝦中活性最高,而不同組織中則以肝臟中活性最高,鰓中活性最低。該研究表明,海洋生物體內(nèi)?;撬岬暮铣蓸O有可能是通過半胱氨酸雙加氧酶途徑,其活性的大小一定程度上決定了海洋生物體內(nèi)?;撬岬乃?。

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