廖國建，彭希希，田俊，謝建平

1 西南大學 藥學院 現(xiàn)代生物醫(yī)藥研究所，重慶 400716

2 西南大學 生命科學學院 現(xiàn)代生物醫(yī)藥研究所 三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境與生物資源省部共建國家重點實驗室培育基地，重慶 400715

達托霉素 (Daptomycin) 是一種用于治療革蘭氏陽性菌感染的脂肽抗生素，2003年被美國FDA批準用于治療革蘭氏陽性菌引起的復雜皮膚感染和結構性皮膚感染，2006年被批準用于治療金黃色葡萄球菌導致的菌血癥和右側心內膜炎[1]。2016年我國食品藥品監(jiān)督總局 (CFDA) 批準了華東醫(yī)藥和恒瑞醫(yī)藥生產達托霉素。達托霉素已成為治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (MRSA)和耐萬古霉素腸球菌 (VRE) 等高致病性耐藥菌導致感染的一線用藥。批準上市10余年來致病菌對達托霉素的最小抑菌濃度 (MIC) 沒有顯著變化[2]，耐藥比例很低，彰顯了達托霉素獨特的優(yōu)勢。

由于日益重要的臨床價值，達托霉素作用機制和耐藥性研究是非常活躍的研究領域。研究主要集中在金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、腸球菌Enterococcus faecium和Enterococcus faecalis、鏈球菌Streptococcus mitis和Streptococcus oralis，這些微生物利用不同的適應性途徑介導達托霉素耐藥(表1)。文中在介紹達托霉素作用機制最新進展的基礎上，重點總結了金黃色葡萄球菌和腸球菌耐藥基因及其分子機制。

表1 重要致病菌達托霉素耐藥相關基因Table 1 Genes associated with daptomycin resistance in major pathogens

1 達托霉素的作用機制

達托霉素通過鈣離子 (Ca2+) 依賴的方式靶向革蘭氏陽性菌細胞膜[14]。達托霉素與 Ca2+以1∶1的比例結合后寡聚化形成膠束，然后插入到細胞膜中發(fā)揮殺菌活性。帶正電的達托霉素-鈣離子復合物主要與細胞膜中帶負電荷的磷脂酰甘油(PG) 和心磷脂 (CL) 等相互作用，導致細胞膜去極化，細胞內容物包括鉀離子等的外排，最終導致細胞死亡。達托霉素對細胞壁生物合成的影響和細胞死亡的機制尚未完全闡明。最近的研究表明達托霉素激活了枯草芽孢桿菌細胞膜液脂(Fluid lipid) 微結構域的重排，導致細胞膜逐漸去極化[15]。微結構域重排影響脂質Ⅱ合成酶 MurG和磷脂合成酶PlsX的定位，導致細胞膜磷脂和細胞壁組分合成異常。雖然液脂微結構域也在葡萄球菌和鏈球菌等病原菌中被觀察到，病原菌是否采用類似的機制尚不明確。除了破壞參與細胞壁合成酶的定位外，達托霉素也抑制青霉素結合蛋白Pbp2a的表達。該酶在β-內酰胺抗生素存在的條件下是肽聚糖合成的關鍵酶。Pbp2a表達量降低恢復MRSA對β-內酰胺抗生素的敏感性。最終β-內酰胺抗生素選擇性抑制 Pbp1促進達托霉素結合到細胞膜，從而增加細菌對達托霉素的敏感性，達托霉素抑制Pbp2a的表達導致細菌恢復對β-內酰胺抗生素的敏感性，這種現(xiàn)象稱為反向放大效應 (Seesaw effect)[16]。

2 致病菌耐受達托霉素的機制

越來越多的證據表明病原菌主要通過改變細胞壁和細胞膜結構或電荷來耐受達托霉素[7,17]。細胞膜磷脂代謝由多個酶參與 (圖 1)，合成細胞所需的各種不同磷脂。PG的含量與達托霉素耐藥密切相關，降低 PG的合成或增加其轉化為賴氨酰磷脂酰甘油 (L-PG) 和 CL的比例都會提高細菌對達托霉素的耐藥性。信號轉導途徑全局性地影響細胞壁的成分和電荷，調控細胞壁的結構動態(tài)也是細菌達托霉素耐藥的重要因素。

2.1 細胞膜磷脂代謝酶介導達托霉素耐藥

2.1.1 MprF

mprF編碼一個跨膜雙功能酶，由包含14個跨膜結構域的氨基端和1個位于胞質的羧基端所組成。羧基端負責催化磷脂酰甘油 (PG) 的賴氨?；?，氨基端跨膜結構域具有翻轉酶活性，負責將 L-PG從細胞膜內側轉位到細胞膜外側[18]。由于 L-PG帶正電荷的性質，導致細胞膜外側負電荷減少。

mprF突變與金黃色葡萄球菌達托霉素耐藥相關，mprF缺失導致細菌對達托霉素更敏感[19]。此外，通過反義RNA技術特異性地降低mprF的轉錄也導致耐藥菌株恢復對達托霉素的敏感性[20]。在缺失mprF的突變株中，表達耐藥突變株中的mprF導致回補菌株提高了達托霉素抗性，而表達野生型菌株的mprF則沒有這種效果。分析耐藥菌株的mprF序列發(fā)現(xiàn)，mprF突變主要集中在酶的熱點區(qū)域 (圖 2)，主要位于中央跨膜結構域和羧基端結構域，這些突變很多是功能獲得性(Gain-of-function) 突變，能夠增加mprF的表達量或者提高酶的活性[2]。腸球菌中含有兩個mprF，其中mprF2發(fā)揮主要作用，其具有更廣泛的底物范圍，能夠形成賴氨酸、丙氨酸和精氨酸修飾的 PG。敲除mprF2導致對多粘菌素等抗菌肽更敏感，然而對達托霉素的抗性沒有改變，這表明達托霉素耐藥機制可能具有菌株特異性。

圖1 革蘭氏陽性細菌主要磷脂結構及其生物合成途徑Fig. 1 Chemical structure (A) and biosynthetic pathway(B) of the major phospholipids in Gram-positive bacteria.PA: phosphatidic acid; CDP-DAG: CDP-diacylglycerol;PS: phosphatidylserine; PE: phosphatidylethanolamine;G-3-P: glycerol-3-phosphate; PG-P: phosphatidylglycerol-3-P; PG: phosphatidylglycerol; CL: cardiolipin.

圖2 達托霉素耐藥金黃色葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)的 MprF突變位點Fig. 2 Mutations in MprF identified in daptomycin resistant S. aureus. TM: transmembrane domain.

研究發(fā)現(xiàn)并非所有的mprF突變都改變了細胞膜的電荷[11]。此外，人工磷脂囊泡中改變L-PG的含量對達托霉素的結合僅有很小的影響[12]，因此MprF可能通過控制PG的濃度、改變細胞膜脂類的分布等因素影響達托霉素的寡聚化和介導達托霉素耐藥。

2.1.2 Cls

cls編碼心磷脂合成酶，利用兩分子PG合成一分子CL，負責細胞膜心磷脂的生物合成。該酶的突變會改變細胞膜中PG和CL的比例。在金黃色葡萄球菌中，Cls 的K61缺失和位于磷脂酶D結構域的R218Q突變等參與達托霉素耐藥[3]。在敏感菌株中過表達含 R218Q突變基因顯著提高達托霉素抗性，導致菌株的MIC從4 μg/mL上升為64 μg/mL。同樣的R218Q突變也在耐藥屎腸球菌被發(fā)現(xiàn)，這些結果暗示Cls也是腸球菌中達托霉素耐藥的關鍵酶[12]。異源表達純化R218Q突變蛋白和酶活性測定發(fā)現(xiàn)，突變蛋白合成心磷脂的能力增加，令人意外的是，突變株和野生型菌株相比心磷脂含量并未發(fā)生顯著變化。二維薄層色譜分析細胞膜磷脂時發(fā)現(xiàn)，耐藥菌株比野生型菌株中含有更低的 PG和甘油磷酸-二酰甘油含量 (CDP-DAG)[21]。這表明增強 Cls活性可能通過降低細胞膜中的PG含量進而改變細胞膜的特征。這種效果與金黃色葡萄球菌中mprF突變效果類似。

2.1.3 CdsA

緩癥鏈球菌和口腔鏈球菌容易產生高度達托霉素耐藥突變株 (>256 μg/mL)。測序3株耐藥菌時發(fā)現(xiàn)，突變株都含有cdsA基因突變 (Q31*、G246C和 D249N)(13)。cdsA編碼胞苷酰轉移酶負責催化磷脂酸 (PA) 為CDP-DAG。cdsA在多數(shù)細菌中都是必需基因，合成細胞生存所需的各種脂類。令人意外的是，由于尚不清楚的機制，cdsA在緩癥鏈球菌和口腔鏈球菌中是非必需基因。cdsA突變導致菌株完全喪失了合成PG和CL的能力，大量積累PA。篩選這3株耐藥菌株回復突變株時發(fā)現(xiàn)，Q31*的終止密碼子轉變?yōu)樯彼崦艽a子，使得蛋白能夠正常翻譯；C246突變?yōu)榻z氨酸密碼子，恢復該區(qū)域的柔性；N249則恢復為野生型天冬氨酸密碼子。這些結果表明cdsA介導緩癥鏈球菌和口腔鏈球菌達托霉素耐藥性。

圖3 達托霉素耐藥腸球菌 (藍色) 和金黃色葡萄球菌 (紅色) 中Cls突變位點[2]Fig. 3 Mutations in Cls identified in daptomycin resistant S. aureus (red) and Enterococci (blue)[2]). TM:transmembrane domain; PLD: phospholipase domain.

2.1.4 PgsA

細菌可以調控細胞膜磷脂合成的不同步驟來影響PG的含量。除了前文提到的cdsA、cls和mprF外，還包括pgsA等。pgsA編碼磷脂酰甘油合成酶，催化CDP-DAG合成磷脂酰甘油?？莶菅挎邨U菌中，達托霉素耐藥菌株中含有pgsA突變 (A64V)[8]，耐藥菌株中PG的含量比野生型低5倍，達托霉素MIC提高30倍。

2.2 細胞外膜應激調控網絡

除了細胞膜磷脂代謝關鍵酶外，細胞外膜應激調控網絡介導的細胞全局性改變也在達托霉素耐藥過程中發(fā)揮了重要作用。在金黃色葡萄球菌中主要涉及雙組分系統(tǒng)VraSR和YycFG，而在腸球菌中主要涉及三組分系統(tǒng)LiaFSR。

2.2.1 YycFG (WalKR)

YycFG (WalKR) 是金黃色葡萄球菌等低G+C革蘭氏陽性致病菌中的重要雙組分系統(tǒng)，調控細胞壁合成和代謝、細胞膜完整性、細胞分裂、脂類代謝等多種功能[22]。YycF為應答調節(jié)蛋白，YycG為組氨酸蛋白激酶。YycG的胞內部分可分為HAMP連接子、PAS折疊感應域、二聚化組氨酸磷酸轉移域和ATPase酶結構域。這個系統(tǒng)還包括輔助基因yycI和yycH。YycH和YycI都是氨基端跨膜蛋白，胞外的羧基端結構域在枯草芽孢桿菌中抑制YycG 組氨酸激酶活性[15]。在非分裂的細胞中，YycFGHI復合體在整個細胞膜中都有分布，在細胞分裂時 YycG定位于細胞分裂處，該位點也是達托霉素在細胞膜上的插入位點。YYcG可能通過感受細胞膜流動性的改變，進而調整細胞壁的交聯(lián)度來應對細胞應激。

在耐藥菌株中發(fā)現(xiàn)了數(shù)個YycG的突變位點，如位于PAS (R236C) 和HAMP (S221P) 的突變。另一個研究發(fā)現(xiàn)效應蛋白WalkR的突變也與達托霉素耐藥相關，A96T突變位于保守的區(qū)域，影響磷酸化介導的蛋白構象改變；而K208R突變位于DNA結合區(qū)域，突變導致MIC提高4倍[6]。耐藥突變也發(fā)生在輔助基因有yycH，移碼突變導致蛋白截短。yycG突變也在耐藥糞腸球菌中被觀察到。達托霉素耐藥表型與yycFG表達不足的表型類似，突變可能影響了操縱子的功能，下調細胞壁結構動態(tài)來應對達托霉素的攻擊。

2.2.2 VraSR

VraSR 是低 G+C革蘭氏陽性細菌中高度保守的雙組分系統(tǒng)，通過調控pbp2(青霉素結合蛋白 2)、tagA(參與 WTA 合成)、prsA(伴侶蛋白) 和murA(UDP-N-乙酰葡萄糖胺烯醇式丙酮酸轉移酶) 的轉錄控制細胞壁的合成[7]。達托霉素處理導致金黃色葡萄球菌vraSR表達上調。在耐藥菌株中失活vraSR導致菌株達托霉素敏感，并伴隨更薄的細胞壁。上調vraSR的轉錄與達托霉素耐藥相關。此外，vraS的點突變 (E276K) 也導致耐藥[9]。

2.2.3 LiaFSR

腸球菌利用 LiaFSR三組分調控系統(tǒng)應對細胞膜壓力，類似于金黃色葡萄球菌的VraSR調控系統(tǒng)。在枯草芽孢桿菌中，LiaFSR系統(tǒng)在達托霉素存在條件下被激活。liaFSR基因突變在耐藥腸球菌中被發(fā)現(xiàn)。在耐藥糞腸球菌中發(fā)現(xiàn)了liaF的突變，突變導致Ile177缺失。在敏感菌株中替換耐藥株的liaF導致MIC提高4倍[10]。許多耐藥屎腸球菌菌株含有l(wèi)iaFSR突變[7]。liaR缺失導致心磷脂的重新分配和達托霉素遠離分裂位點[11]。

2.3 其他機制

最近的研究表明，金黃色葡萄球菌通過主動釋放細胞膜磷脂作為誘餌來結合和失活達托霉素，阻止達托霉素結合到細胞膜上[23]。該過程受Agr密度感應系統(tǒng)的調控，細菌通過表達一種小分子肽毒素 PSMα削弱這種防護機制。苯唑西林的使用也能抑制細胞膜磷脂的釋放。達托霉素的高度耐藥常常需要多個基因的參與，糞腸球菌達托霉素耐藥菌株中發(fā)現(xiàn)了gdpD(I170 缺失) 和liaF(I177缺失) 突變。gdpD編碼的跨膜蛋白參與磷脂代謝。野生型菌株中導入突變株的liaF導致突變菌株的MIC從1 μg/mL變?yōu)? μg/mL，單獨導入gdpD不足以獲得達托霉素抗性。有趣的是，當野生型菌株同時引入突變的liaF和gdpD時，達托霉素的耐藥性變?yōu)?2 μg/mL，這表明這兩個基因相互作用，導致了高水平達托霉素耐藥性[10]。

2.4 達托霉素耐藥的工作模型

歸納整合已有證據構建病原菌耐藥的工作模型如圖4所示。重要致病菌主要通過改變細胞膜磷脂代謝關鍵酶的表達或者活性，控制細胞膜中PG的含量，以及直接釋放PG到細胞外捕獲達托霉素-鈣離子復合物，最終降低達托霉素與細胞膜的結合量。此外，通過信號轉導途徑全局性地影響細胞壁的成分和電荷，調控細胞壁的穩(wěn)態(tài)，降低達托霉素通過細胞壁的能力。細菌整合多種耐藥機制最終實現(xiàn)達托霉素耐藥。

圖4 達托霉素耐藥機理Fig. 4 Resistance to daptomycin. The membrane-associated proteins involved in phospholipid metabolism(CdsA, PgsA, MprF and Cls) play an important role in daptomycin resistance through controlling the content and concentration of PG. Furthermore, daptomycin can be sequestered by the free PG and can be repelled by the structure or charge change of important cell wall ingredients. The cell wall homeostasis is under control of important signal transduction pathway, such as YycFG,VraSR and LiaFSR.

3 總結與展望

過去 10年，多重耐藥革蘭氏陽性菌株的顯著增加使達托霉素成為治療嚴重感染的重要選擇。達托霉素強力殺菌活性和獨特的殺菌機理使其受到臨床醫(yī)生的青睞。達托霉素的大量使用，使得耐藥菌株也變得越來越普遍。此外，放線菌如達托霉素產生菌玫瑰孢鏈霉菌和結核分支桿菌對達托霉素天然耐藥，限制了這種重要抗生素用于防控日益嚴重的結核病威脅，筆者課題組正在利用功能基因組學手段揭示結核菌和玫瑰孢鏈霉菌達托霉素耐藥的分子機制，研究結果有望豐富耐藥的途徑和方式，并為達托霉素用于結核病治療奠定基礎。隨著耐藥菌株耐藥分子機制的進一步闡明和宿主環(huán)境對達托霉素敏感性影響機理的深入研究，將為提高達托霉素活性的新治療手段提供重要靶點，為感染性疾病的防控發(fā)揮更大的作用。

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