陳鄭珊，遲象陽，范鵬飛，張冠英，王美榮，于長明，陳薇

軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100071

隨著計算機性能不斷增強以及模擬計算方法不斷成熟，出現(xiàn)了應(yīng)用在生物領(lǐng)域的分子模擬方法，能夠通過計算機模擬對生物大分子進行研究。在眾多的模擬方法中，分子對接已成為其中最重要和應(yīng)用最廣泛的方法之一。分子對接主要是考察和預(yù)測兩個分子在復(fù)合物中的結(jié)合模式，分子對接在抗原-抗體的研究中有著重要的應(yīng)用。在抗體-抗原性質(zhì)的研究中，表位信息是研究人員最為關(guān)心的方面之一，相對于主流的實驗方法，分子對接模擬在抗原表位 (尤其是空間構(gòu)象性表位)的預(yù)測和輔助篩選方面具有特別的優(yōu)勢[1]，分子對接結(jié)果能夠提供對闡明抗體中和機制有價值的線索[2-3]。然而在對接產(chǎn)生的大量對接構(gòu)象中，近天然結(jié)構(gòu)占很小的比例，如何將這些結(jié)構(gòu)篩選出來仍是一個具有挑戰(zhàn)性的問題[4]。相關(guān)工作有所進展[5-6]，但目前尚無一個普適性好、準確性高的打分函數(shù)可以實現(xiàn)這一篩選目的。本文將 QSAR的原理應(yīng)用于抗原抗體對接模擬構(gòu)象的篩選 (近天然結(jié)構(gòu)預(yù)測)。即用數(shù)理統(tǒng)計方法抽提抗原-抗體復(fù)合物模擬構(gòu)象的近天然程度與其抗原-抗體接觸面的理化特性、能量特性之間的定量變化規(guī)則。通過對抗原-抗體接觸面描述符和能量參數(shù)的回歸分析，建立用于篩選近天然構(gòu)象的數(shù)學(xué)模型。所得數(shù)學(xué)模型主要適用于抗原-抗體對接體系，在測試集驗證和埃博拉病毒的包膜蛋白4G7抗體結(jié)合模式預(yù)測應(yīng)用中具有較好的表現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 抗原-抗體接觸面描述符和能量參數(shù)

候選的抗原抗體接觸面描述符：①接觸面面積；②接觸面上氫鍵密度；③接觸面上 cation-π密度；④EPII[7](Epitope-paratope interface index)；⑤ZDock Score[8](基于格點的幾何互補性打分)；⑥ZRank Score[9]；⑦ ZRank VdW；⑧ ZRank Elec；⑨ZRank Solv。其中，ZRank Score是ZRank VdW

(Van der Waals energies)、ZRank Elec (Electrostatics energies) 和 ZRank Solv (Desolvation energies) 的線性組合。EPII是抗原-抗體接觸面上氨基酸對偏好系數(shù)的線性組合：

Ni(x,y)表示氨基酸對(x,y)在接觸面i上的數(shù)量，F(xiàn)i(x,y)則表示表示氨基酸對(x,y)在接觸面i上出現(xiàn)的頻率 (注：x表示抗原上的氨基酸，y表示抗體上的氨基酸)。Tharakaraman等[7]統(tǒng)計了84個抗原-抗體復(fù)合物結(jié)構(gòu)接觸面上的氨基酸對出現(xiàn)的頻率，表示為20×20的矩陣RA，作為抗原-抗體接觸面上氨基酸對偏好系數(shù)矩陣。接觸面上殘基類型的偏好性[10]可能與接觸面上廣泛存在的陽離子-π (Cation-π) 相互作用有關(guān)[11]，將接觸面上 cation-π密度列為候選的描述符。ZDock Score基于格點算法表征兩個對接單體的形狀互補性。ZRank Score表征范德華作用能、靜電作用能和溶劑化作用能的綜合影響。

接觸面描述符及能量參數(shù)⑤⑥⑦⑧⑨由BIOVIA Discovery Studio 4.5軟件平臺的對接模擬程序 (ZDOCK[8]) 計算得到；①②③④是自行使用 Perl語言編寫程序計算得到，BIOVIA Discovery Studio 4.5軟件[12]的客戶端所提供的應(yīng)用程序編程接口 (Discovery Studio scripting API)，相當于Perl語言的擴展函數(shù)庫，為編寫程序操作生物分子模型及相關(guān)數(shù)據(jù)的處理提供了很大的便利。

1.2 模擬結(jié)構(gòu)準確程度標準的定義

將兩個對接單體 (即抗原和抗體) 上距離另一個單體不超過4.5 ?的氨基酸定義為接觸面氨基酸。將兩個復(fù)合物結(jié)構(gòu)中接觸面上的相同氨基酸重疊后，計算接觸面氨基酸上的重原子 (非氫原子) 的RMSD值，即I_RMSD[13]。I_RMSD描述了抗原-抗體接觸面在原子水平上的準確度。如果某個模擬對接結(jié)構(gòu)與相應(yīng)實驗測定的晶體結(jié)構(gòu) (下載自PDB 數(shù)據(jù)庫http://www.rcsb.org/) 的I_RMSD小于2.0 ?，則認為該模擬對接結(jié)構(gòu)是近天然結(jié)構(gòu)。

1.3 抗原-抗體分子對接

在BIOVIA Discovery Studio 4.5生命科學(xué)分子模擬軟件平臺上使用 ZDOCK[8]程序進行分子對接得到抗原-抗體反應(yīng)的計算生成構(gòu)象模型。對接過程主要使用抗體的可變區(qū)部分作為受體，使用抗原作為配體。ZDOCK計算過程中采用6°歐拉角度進行結(jié)合構(gòu)型采樣 (構(gòu)象空間搜索)，最終樣本包括54 000個結(jié)合構(gòu)象模型。

1.4 準備訓(xùn)練集和測試集數(shù)據(jù)

選用由 Hwang等[14]提出的 Protein-Protein Docking Benchmark Version 4.0中的抗原-抗體復(fù)合物結(jié)構(gòu)作為篩選算法的研究對象。所選用的 37個抗原-抗體復(fù)合物結(jié)構(gòu)均收集自PDB (Protein data bank)[15]，分辨率高于3.25 ?，氨基酸鏈長度不少于30個殘基，抗體部分均包含輕鏈和重鏈可變區(qū)。在全部 37個抗原-抗體復(fù)合物結(jié)構(gòu)中再隨機選取19個抗原-抗體復(fù)合物結(jié)構(gòu) (表 1) 用于數(shù)學(xué)模型的訓(xùn)練，其余18個抗原抗體復(fù)合物結(jié)構(gòu) (表2) 作為測試對象。對于每一個的抗原-抗體復(fù)合物結(jié)構(gòu)，其本身是實驗測定結(jié)構(gòu)，作為標準結(jié)構(gòu)使用，拆分出其兩個單體 (即抗原和抗體) 進行ZDOCK對接得到54 000個對接模擬構(gòu)象 (Decoy model)，分別計算出每個對接模擬構(gòu)象與標準結(jié)構(gòu)間的I_RMSD值。從ZDock Score打分排序在前2 000名的對接模擬構(gòu)象中選取I_RMSD值最小者 (要求其I_RMSD值必須小于2.0 ?) 作為近天然結(jié)構(gòu)，如果該 2 000個對接模擬構(gòu)象的I_RMSD值均不小于2.0 ?，則以相同標準從全部54 000個對接模擬構(gòu)象中選取 I_RMSD值最小者。再對該2 000個對接模擬構(gòu)象進行聚類分析，RMSD Cutoff參數(shù)設(shè)定為10.0，即同一個聚類簇(Cluster) 中的不同構(gòu)象模型間的RMSD值<10 ?，而來自不同簇間的構(gòu)象模型的RMSD值≥10 ?。聚類分析得到101個聚類簇，除去近天然結(jié)構(gòu)所在的聚類簇后 (如果近天然結(jié)構(gòu)不屬于任何一個聚類簇，則除去包含對接模擬構(gòu)象最少的一個聚類簇)，選取余下100個聚類簇的代表元作為不合理結(jié)構(gòu)。即從對接結(jié)果中選出 1個近天然結(jié)構(gòu)(I_RMSD<2.0 ?) 和 100個不合理結(jié)構(gòu)，并構(gòu)成一個具有101個構(gòu)象元素的訓(xùn)練集體系或測試集體系?？偣驳玫?9個訓(xùn)練集體系和18個測試集體系。需要說明的是，其中有1個訓(xùn)練集體系由101個不合理構(gòu)象組成 (因為54 000個對接模擬構(gòu)象中的I_RMSD值均不小于2.0 ?)。

通過BIOVIA Discovery Studio 4.5軟件和自行設(shè)計編寫的Perl語言程序的計算得出訓(xùn)練集體系和測試集體系中所有對接模擬構(gòu)象的接觸面描述符和能量參數(shù)。在各體系內(nèi)對各項參數(shù)進行標準化(歸一化) 處理，作為數(shù)學(xué)模型的自變量。定義因變量Y，對于訓(xùn)練集體系中的每一個對接模擬構(gòu)象，若該構(gòu)象是近天然結(jié)構(gòu)，則Y=1；若該構(gòu)象是不合理結(jié)構(gòu)，則Y=0。其中數(shù)據(jù)的批量處理和格式轉(zhuǎn)換等操作也是由自行編寫的Perl語言程序完成。

表1 訓(xùn)練集的19個抗原-抗體復(fù)合物Table 1 Training dataset of antigen-antibody complexes (total number of complexes=19)

1.5 二值資料多重logistic回歸分析

準備好的訓(xùn)練集體系數(shù)據(jù)中含有一個定性變量：是否近天然結(jié)構(gòu) (即Y，取值為 0或 1)，以及9個定量變量：①接觸面面積；②接觸面上氫鍵密度；③接觸面上 cation-π密度；④EPII；⑤ZDock Score；⑥ZRank Score；⑦ZRank VdW；⑧ZRank Elec ； ⑨ZRank Solv 。 進行 證實 性 研究 ，以是否近天然結(jié)構(gòu) (Y) 為因變量，以上述9個定量變量為自變量，擬合logistic回歸模型并采用逐步法篩選變量。P(Y=1)即P(This decoy is native-like)。自變量篩選以及 logistic回歸分析使用專業(yè)的統(tǒng)計軟件SAS 9.2完成。

表2 測試集的18個抗原-抗體復(fù)合物Table 2 Testing dataset of antigen-antibody complexes (total number of complexes=18)

1.6 測試集對數(shù)學(xué)模型的驗證

將測試集體系內(nèi)各個對接模擬構(gòu)象的接觸面描述符和能量參數(shù)代入回歸方程中，計算出各個構(gòu)象模型的P(This decoy is native-like)值，并在各個體系內(nèi)按P(This decoy is native-like)由高到低的降序?qū)?gòu)象模型進行排序。統(tǒng)計各個測試集體系排名在前5位的對接構(gòu)象模型中是否存在近天然結(jié)構(gòu)，如果存在，則認為所建立的數(shù)學(xué)模型適用于該體系，成功篩選出該體系中的近天然結(jié)構(gòu)。采用僅由 ZDock Score或ZRank Score打分排序的方法作為對照，采用相同的篩選成功與否的認定標準。該部分數(shù)據(jù)計算和統(tǒng)計等處理均由自行編寫的Perl語言程序完成，BIOVIA Discovery Studio 4.5軟件無相關(guān)功能。

1.7 預(yù)測埃博拉包膜蛋白與其中和抗體 4G7的結(jié)合模式

埃博拉病毒的包膜蛋白 (Glycoprotein，GP)在病毒入侵過程中扮演著關(guān)鍵的角色，是疫苗和抗體研究的重要靶標?？贵w組合ZMapp (2G4，4G7，13C6)[16]是治療埃博拉病毒感染的雞尾酒療法之一，組成ZMapp的中和抗體就結(jié)合于GP上的表位。使用從PDB數(shù)據(jù)庫中下載的GP晶體結(jié)構(gòu)[17](PDB ID: 3CSY) 和 4G7電鏡結(jié)構(gòu)[18](PDB ID: 5KEN) 在Discovery Studio 4.5軟件中運用ZDOCK程序進行對接模擬。繼而在生成的54 000個對接模擬構(gòu)象中取出按ZDock Score排序在前5 000名的構(gòu)象。計算出這5 000個構(gòu)象的接觸面描述符和能量參數(shù)并代入數(shù)學(xué)模型中得到P(This decoy is native-like)，對P(This decoy is native-like)值最大的對接模擬構(gòu)象使用基于機器學(xué)習(xí)的KFC2算法[19]預(yù)測抗原在接觸面上的熱點氨基酸 (關(guān)鍵氨基酸)。將篩選出的對接模擬結(jié)構(gòu)與抗原-抗體復(fù)合物的電鏡結(jié)構(gòu) (PDB ID: 5KEN) 相對比；將預(yù)測的抗原上的關(guān)鍵氨基酸與文獻報道的實驗數(shù)據(jù)相對比。

2 結(jié)果與分析

2.1 多重logistic回歸分析得到數(shù)學(xué)模型

利用統(tǒng)計軟件SAS 9.2進行回歸分析，得到的有統(tǒng)計學(xué)意義的模型自變量：①接觸面面積 (X1)；②接觸面上的氫鍵密度 (X2)； ③ EPII (X3)；④ZDock Score (X4)，⑤ ZRank Score (X5)，對各參數(shù)進行檢驗的P值均小于0.05。由此建立回歸方程：

對整個模型進行假設(shè)檢驗，原假設(shè)是所有的回歸系數(shù)都為 0，分別使用似然比、計分檢驗和Wald檢驗3種檢驗方法，3種方法的P值都小于0.05，可以認為該模型是成立的。ROC曲線的曲線下面積為0.994，預(yù)測概率和觀察響應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)性較強。

2.2 測試集對數(shù)學(xué)模型的驗證效果

經(jīng)測試，在全部18個測試體系中，模型成功篩選出了其中的15個體系中的近天然結(jié)構(gòu)。作為對照，在全部18個測試體系中，ZDock Score打分方法成功篩選出了其中的6個體系中的近天然結(jié)構(gòu)，ZRank Score打分方法僅成功篩選出了其中5個體系中的近天然結(jié)構(gòu) (表3)。對于18個測試體系 (共包含1 818個對接模擬構(gòu)象)，該數(shù)學(xué)模型篩選方法的有效性和成功率明顯優(yōu)于 ZDock Score打分方法和ZRank Score打分方法。

表3 測試集的預(yù)測結(jié)果Table 3 Prediction results of testing dataset (total number of complexes=19)

2.3 中和抗體4G7結(jié)合模式預(yù)測結(jié)果

文獻[20]報道抗體4G7結(jié)合在GP Base上，抗原-抗體復(fù)合物電鏡結(jié)構(gòu)和實驗數(shù)據(jù)表明Cys511、Asp552和Cys556是抗原上與抗體結(jié)合密切相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸。應(yīng)用數(shù)學(xué)模型得到的排序第一的對接構(gòu)象模型，其抗原部分的 KFC2熱點氨基酸 (關(guān)鍵氨基酸) 預(yù)測結(jié)果是 GP上的Asn506、Lys510、Cys511、Pro513、Asn550、Gln551、Asp552、Cys556，預(yù)測結(jié)果包含了全部3個文獻報道的關(guān)鍵氨基酸 (粗體)。運用抗原-抗體分子對接并通過回歸分析建立的數(shù)學(xué)模型篩選出與電鏡結(jié)構(gòu)相接近的近天然結(jié)構(gòu)，有效預(yù)測出了抗體4G7與相應(yīng)抗原的大致結(jié)合模式和以實驗方法確定的關(guān)鍵氨基酸 (圖1)。

圖1 埃博拉包膜蛋白中和抗體4G7結(jié)合表位的預(yù)測結(jié)果Fig. 1 Result of predicting epitope of anti-Ebola glycoprotein MAb 4G7. (A) Binding hot spots predicted by KFC Server. Residues critical for MAb 4G7 binding are highlighted in yellow. (B–E) Superposition of docking model and cryo-electron microscopy structure (PDB accession No. 5KEN) on fixed Ebola virus glycoprotein. Docking model is shown with glycoprotein colored green and MAb 4G7 colored yellow in which the heavy chain CDR3 loop is colored in purple. Cryo-electron microscopy structure is shown with glycoprotein colored blue and MAb 4G7 colored brown in which the heavy chain CDR3 loop is colored in red.

3 討論

定量構(gòu)效關(guān)系方法[21](Quantitative structure activity relationship，QSAR) 采用數(shù)理統(tǒng)計方法研究和揭示化合物活性與其分子結(jié)構(gòu)或理化特性之間的定量變化規(guī)則，在小分子藥物設(shè)計中有重要的應(yīng)用。本文將QSAR的原理應(yīng)用于抗原抗體對接模擬構(gòu)象中近天然結(jié)構(gòu)的篩選。即用數(shù)理統(tǒng)計方法抽提對接模擬構(gòu)象的近天然程度與其抗原抗體接觸面的理化特性、能量特性之間的定量變化規(guī)則。經(jīng)回歸分析，選定抗原-抗體接觸面面積、接觸面上氫鍵密度、EPII、ZDock Score和ZRank Score作為數(shù)學(xué)模型的自變量，建立多重 logistic回歸方程。作為自變量的各參數(shù)由 BIOVIA Discovery Studio 4.5軟件平臺和自行編寫的Perl語言程序計算得到，并需要進行標準化 (歸一化)處理。使用所建立的多重 logistic回歸方程指導(dǎo)從眾多對接模擬構(gòu)象中篩選出近天然結(jié)構(gòu)取得較為理想的效果。在全部 18個測試集體系中，該方法可將其中 15個體系中的近天然結(jié)構(gòu)排序在前5位，其中12個體系中的近天然結(jié)構(gòu)排序在第1位，該方法對抗原-抗體近天然結(jié)構(gòu)的篩選效果優(yōu)于單純使用ZRank Score或ZDock Score打分的排序篩選方法?；谠摵Y選方法在測試集驗證中的良好表現(xiàn)，嘗試將該方法應(yīng)用于埃博拉病毒的包膜蛋白與其中和抗體4G7的結(jié)合模式預(yù)測。將 GP晶體結(jié)構(gòu)與抗體 4G7的電鏡結(jié)構(gòu)進行ZDOCK對接，只有能夠從生成的54 000個對接模擬構(gòu)象中篩選出近天然結(jié)構(gòu)，后續(xù)的熱點氨基酸預(yù)測才能得到較為符合實際情況的結(jié)果。運用該數(shù)學(xué)模型計算后，取P(This decoy is native-like)值最大的對接模擬構(gòu)象進行 KFC2熱點氨基酸預(yù)測，預(yù)測出8個熱點氨基酸，包括了文獻報道的全部3個抗原上的關(guān)鍵氨基酸。熱點氨基酸預(yù)測結(jié)果說明該對接模擬構(gòu)象中抗原-抗體的結(jié)合方式 (尤其是接觸面特征) 是接近真實情況或具有部分真實情況特點的。對抗體4G7大致結(jié)合模式的成功預(yù)測也在一定程度上說明了本文所提出的抗原-抗體近天然結(jié)構(gòu)篩選方法具有可行性與實用性。

現(xiàn)有生命科學(xué)分子模擬軟件平臺，如Discovery Studio、HADDOCK[22]、RosettaDock[23]、AutoDock[24]、ClusPro[25]、PatchDock[26]、HDOCK[27]等，提供了分子對接程序及相應(yīng)打分函數(shù)。可以通過蛋白質(zhì)分子對接的方法研究蛋白質(zhì)結(jié)合模式，但是對接過程中的全構(gòu)象搜索產(chǎn)生成千上萬的對接模擬構(gòu)象，通用的打分函數(shù)很難滿足我們進一步準確篩選出近天然結(jié)構(gòu)的需要。不同類型蛋白質(zhì)的結(jié)合具有各自特點和規(guī)律，可以通過對已有同類型蛋白質(zhì)復(fù)合物共晶體結(jié)構(gòu)的分析和統(tǒng)計得到相應(yīng)的經(jīng)驗規(guī)律，而借鑒QSAR原理，運用多重回歸分析的數(shù)學(xué)模型是將這些經(jīng)驗規(guī)律與已有打分函數(shù)相結(jié)合的有效途徑。本文探索了蛋白質(zhì)結(jié)合表面統(tǒng)計性、經(jīng)驗性特征與ZDOCK、ZRank打分函數(shù)的聯(lián)合使用方法，證明了回歸分析建立的數(shù)學(xué)模型用以打分排序和篩選出近天然對接模擬構(gòu)象的可行性，為提高使用分子對接研究蛋白質(zhì)結(jié)合模式的效率和準確性，提供了可行的思路和方法。

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