王云龍，米亞雙，李玉林，王繼創(chuàng)，程蕾，閆生輝，鄧?yán)枥?/p>

1 河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453002

2 河南省生物工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450121

3 鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450121

4 生物標(biāo)志物定量檢測河南省工程實驗室，河南 鄭州 450121

糖鏈抗原 19-9 (Carbohydrate antigen 19-9，CA19-9) 是 Koprowski等發(fā)現(xiàn)的一種由消化系統(tǒng)腫瘤組織所產(chǎn)生的特異性糖蛋白，也是唾液酸 Lewisa血型抗原的標(biāo)志[1-2]。CA19-9屬于消化系統(tǒng)相關(guān)抗原，主要表達(dá)于胰腺上皮細(xì)胞，抗原的分子量約為10 kDa，正常人體血清中的含量小于37 U/mL[3-6]。研究表明，CA19-9在消化系統(tǒng)惡性腫瘤患者體內(nèi)有異常表達(dá)，其中在胰腺癌、膽道癌、胃癌、結(jié)腸癌、食管癌、肝癌中存在較高的陽性率，而胰腺癌患者中CA19-9的陽性率最高，達(dá)到86%，并且在胰腺癌初期，血清中CA19-9的含量達(dá)到406 U/mL，CA19-9可作為胰腺癌重要的早期診斷指標(biāo)之一[7-12]。

目前，國內(nèi)針對CA19-9的檢測方法有放射免疫測定法、化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法等，這些方法需要在實驗室借助設(shè)備進(jìn)行，均不適宜用于床旁快速診斷。熒光快速層析檢測技術(shù)具有安全、費用低、操作簡便、可實現(xiàn)床旁快速檢測等優(yōu)點[13-15]?；诖耍狙芯拷⒘艘环N熒光定量免疫層析快速檢測CA19-9的技術(shù)和方法，以滿足臨床床旁快速檢測和基層社區(qū)醫(yī)院的需要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

PVC板、吸水紙、硝酸纖維素膜 (CN-140)、玻璃纖維棉由鄭州寶賽生物科技公司提供。臨床定值血清標(biāo)本由河南省生物工程技術(shù)研究中心提供。

1.1.2 試劑

羧基修飾時間分辨熒光微球、CA19-9配對單克隆抗體、羊抗鼠IgG、CA19-9線性參考品 (1 000、900、800、400、200、100、50、25、12.5、6.25 U/mL)、CA19-9精密性質(zhì)控品 (400、100、30 U/mL)、特異性質(zhì)控品 (CEA、AFP、CA125、CA153，4份質(zhì)控品中 CA19-9的含量均為 200 U/mL，CEA質(zhì)控品中CEA含量為400 ng/mL，AFP質(zhì)控品中AFP含量為 400 U/mL，CA125質(zhì)控品中 CA125含量為400 U/mL，CA153質(zhì)控品中CA153含量為400 U/mL)均由河南省生物工程技術(shù)研究中心提供。

1.1.3 儀器

熒光免疫層析讀數(shù)儀購自杭州峰航科技有限公司；紫外分析儀 (JY03型) 購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；臺式高速離心機 (H1850) 購自湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；三維噴金點膜儀、微電腦自動斬條機購自上海金標(biāo)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫微球的制備

取 20 μL熒光微球于 1.5 mL離心管中，加入1 000 μL 硼酸緩沖液 (0.05 mol/L，pH 8.0，下同)混勻，13 000 r/min離心15 min，棄上清；加入1 000 μL硼酸緩沖液進(jìn)行重懸，加入15 μL EDC (10 mg/mL)，混勻后室溫振蕩活化18 min，13 000 r/min離心13 min，棄去上清；加1 000 μL硼酸緩沖液進(jìn)行重懸，加入CA19-9標(biāo)記抗體100 μg，振蕩混勻，超聲振蕩5 min，低速振蕩標(biāo)記2 h；14 000 r/min離心20 min，棄上清，400 μL 復(fù)溶液重懸，加入 20 μL BSA (20%)，振蕩混勻，低速振蕩封閉1 h，4 ℃密封保存。

1.2.2 CA19-9熒光免疫層析定量檢測試紙條的制備

調(diào)節(jié)三維平面點膜噴金儀，將 2 mg/mL 的CA19-9包被抗體和 1 mg/mL羊抗鼠包被于 NC膜上分別作檢測線 (T線) 和質(zhì)控線 (C線)，包被量為 1 μL/cm；將制備好的免疫微球噴涂到微球結(jié)合墊上，噴涂量為6 μL/cm。包被抗體的NC膜和微球結(jié)合墊37 ℃干燥1.5 h。將吸水紙、NC膜、結(jié)合墊、樣品墊分別按照相應(yīng)的位置組合于PVC底板上，用微電腦自動斬條機切成 3.8 mm寬的試紙條，組裝卡殼，4 ℃密封保存。

1.2.3 檢測

取 70 μL血清樣本加入到試紙條的點樣窗口，用熒光免疫層析讀數(shù)儀檢測質(zhì)控線與檢測線的熒光強度。

1.2.4 最佳標(biāo)記蛋白量與包被蛋白量的確定

采用二因素多水平實驗確定最佳 CA19-9標(biāo)記抗體與CA19-9包被抗體的量，設(shè)計20 μL熒光微球的標(biāo)記抗體梯度為 40、60、80、100 μg，CA19-9包被抗體濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL。按照1.2.1與1.2.2的方法進(jìn)行試紙條的制備，用線性參考品檢測試紙條的線性范圍與R2。

1.2.5 檢測時間的確定

用線性參考品 (200、100、50 U/mL) 按照 70 μL的加樣量進(jìn)行點樣，分別在點樣后5、8、10、12、15、18、20、22 min檢測試紙條的C、T線熒光強度，記錄T線的熒光值，計算T/C。

1.2.6 方法學(xué)評價

線性范圍：使用CA19-9線性參考品，以T/C的值為縱坐標(biāo)，CA19-9濃度為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立線性方程。

最低檢出限：用空白對照進(jìn)行重復(fù)檢測20次，求出T/C的平均值，+2s代入零濃度和相鄰線性參考品擬合的一次方程得出最低檢出限。

交叉反應(yīng)：取 CEA、AFP、CA125、CA153共4份特異性質(zhì)控品評價試紙條的特異性。

精密性： 用精密性質(zhì)控品 (400、100、30 U/mL)對同一批次和3個不同批次試紙條重復(fù)檢測各10次，分別計算批內(nèi)與批間試紙條的精密性(CV)，計算公式如下：

回收實驗：用基質(zhì)血清將800 U/mL CA19-9血清進(jìn)行稀釋，獲得3份血清，預(yù)測濃度分別為200、100、50 U/mL。用制備好的試紙條進(jìn)行檢測，計算試紙條的回收率。

回收率=測定值/預(yù)測值×100%。

穩(wěn)定性：將制備的試紙條，分別存放于4 ℃和37 ℃，在第6、12、18、21、24天分別用精密性質(zhì)控品 (100 U/mL) 檢測試紙條的T線熒光強度和T/C的值。

臨床評價：用所建立的 CA19-9熒光定量檢測試紙條與羅氏電化學(xué)發(fā)光法檢測試劑盒 (鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢測) 平行檢測 50份臨床血清，對兩種檢測方法進(jìn)行比較，得到相關(guān)性曲線。

2 結(jié)果

2.1 最佳標(biāo)記抗體量與包被抗體濃度的確定

如表 1所示，20 μL熒光微球的標(biāo)記抗體量為 80 μg，包被抗體濃度為 1.5 mg/mL時，試紙條的線性范圍最寬，R2最大，分別為12.5–800.0 U/mL，R2=0.996 8。

2.2 最適檢測時間的確定

實驗結(jié)果見圖 1。由圖可知熒光強度隨時間的變化而增大，12 min后T/C值趨于平穩(wěn)，選擇15 min作為最適檢測時間。15 min后紫外分析儀檢測結(jié)果如圖2所示。

2.3 方法學(xué)評價

線性范圍：測得 CA19-9線性范圍為 12.5–800 U/mL。

最低檢出限：CA19-9熒光層析試紙條的最低檢出限為6.32 U/mL。

特異性：結(jié)果如表2所示，4份特異性質(zhì)控品檢測結(jié)果差異不顯著，本試紙條的特異性較好。

表1 最佳標(biāo)記蛋白量與包被蛋白量結(jié)果Table 1 The best amount of labeling and coating

圖1 最適檢測時間結(jié)果Fig. 1 The results of best detection time.

圖2 15 min紫外檢測結(jié)果Fig. 2 The results of UV detection in 15 min. 1: 50 U/mL;2: 100 U/mL; 3: 200 U/mL.

表2 特異性質(zhì)控品檢測結(jié)果Table 2 The results of specific control test

精密性：3份精密性質(zhì)控品 (400、100、30 U/mL)檢測試紙條批內(nèi)精密性分別為 4.32%±0.16%、5.70%±0.21%、6.02%±0.19%，批間精密性分別為4.26%±0.18%、6.46%±0.23%、7.21%±0.19%。均符合小于15%的要求。

回收實驗：試紙條檢測3份血清的回收率分別為101%、103%和99%，平均回收率為101%，符合要求。

穩(wěn)定性：檢測結(jié)果如圖 3、圖 4所示，試紙條在37 ℃存放24 d后T值明顯下降，但是T/C值無明顯變化，說明試紙條的穩(wěn)定性良好。

圖3 試紙條穩(wěn)定性T值Fig. 3 T value of test strip stability.

圖4 試紙條穩(wěn)定性T/C值Fig. 4 T/C value of test strip stability.

臨床評價：分別用兩種方法對50份樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖5所示，兩種檢測方法的相關(guān)系數(shù)為0.980 6，兩者相關(guān)性良好。

圖5 臨床樣本檢測結(jié)果Fig. 5 The results of clinical sample test.

3 討論

時間分辨熒光免疫層析具有無放射性污染、無背景熒光干擾等優(yōu)點，其原理為血清中的CA19-9在層析作用下，與微球墊上的CA19-9單抗結(jié)合形成其微球-抗體-抗原復(fù)合物，在硝酸纖維素膜的毛細(xì)管作用下與包被在膜上的 CA19-9單抗結(jié)合，15 min后可檢測熒光信號，實現(xiàn)定量檢測。該方法作為POCT發(fā)展的新方向之一，成為目前的研究熱點，在臨床檢測中具有廣闊的發(fā)展前景。

雖然有學(xué)者進(jìn)行 CA19-9時間分辨熒光免疫層析產(chǎn)品的相關(guān)研究，但目前他們的研究水平線性范圍窄，試紙條的準(zhǔn)確度差等。王青[16]、黃飚等[17]分別利用Eu3+作為標(biāo)記物、96孔板作為固相載體進(jìn)行 CA19-9時間分辨熒光免疫分析方法的建立，該方法需進(jìn)行洗滌等一系列繁瑣的操作步驟，檢測設(shè)備昂貴，不適應(yīng)床旁快速檢測。蔣能輝等[18]申請了腫瘤標(biāo)志物的定量檢測試劑條專利，采用CA19-9單克隆抗體與抗IgG抗體分別標(biāo)記熒光微球，包被CA19-9單抗與抗IgG制備檢測試紙條，其試紙條線性范圍為0–200 U/mL，不能完全滿足臨床需要。

為解決試紙條的線性范圍窄、樣品需額外稀釋等問題，我們采用新的思路與方法，在制備工藝微球的偶聯(lián)等方面進(jìn)行諸多創(chuàng)新，采用CA19-9單克隆抗體的單獨標(biāo)記，同時在抗體配對的選擇上采用獨特的方法。本研究設(shè)計二因素多水平實驗對最佳包被抗體量與最佳標(biāo)記抗體量進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)包被抗體量的增加，可使線性范圍增寬，但是包被抗體量過多會引起假陽性率增高。羧基熒光微球經(jīng)過活化后羧基與標(biāo)記抗體的氨基縮合形成酰胺鍵，羧基熒光微球表面的羧基量是一定的，因此熒光微球與 CA19-9標(biāo)記抗體的比例對于試紙條的性能至關(guān)重要。標(biāo)記抗體量過少，熒光強度弱，試紙條靈敏性低；抗體量過多，則造成熒光微球聚集。結(jié)合試驗結(jié)果最優(yōu)與經(jīng)濟的原則，最終確定20 μL微球的最佳CA19-9標(biāo)記抗體量為80 μg，包被抗體濃度為1.5 mg/mL。

熒光微球中包裹了成千上萬個熒光分子，熒光強度高，制備的試紙條在檢測時質(zhì)控線 (C線)和檢測線 (T線) 均能隨著抗原梯度而表現(xiàn)出一定的趨勢。但是試紙條在長期存放過程中，C、T線的熒光值會出現(xiàn)衰減，而T/C的值比較穩(wěn)定。本研究的穩(wěn)定性檢測，將試紙條存放在 4 ℃與37 ℃ (加速破壞實驗) 后，結(jié)果顯示37 ℃存放24 d后T/C的值沒有明顯變化，因此根據(jù)T/C值與抗原濃度建立線性方程。本研究采用線性范圍、精密性、特異性等作為衡量 CA19-9熒光免疫層析試紙條的性能評價標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)過多次重復(fù)，確定線性范圍為 12.5–800 U/mL，批內(nèi)精密性與批間精密性均滿足小于15%的要求，與常見的腫瘤標(biāo)志物 (CEA、AFP、CA125、CA153) 均無交叉反應(yīng)，與羅氏電化學(xué)發(fā)光法對比，其相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.980 6。羅氏電化學(xué)發(fā)光法檢測CA19-9，由于儀器試劑昂貴，對操作人員要求較高，在大型醫(yī)院的檢測費用達(dá)到上百元，檢測時間需要20 min；而CA19-9熒光免疫層析試紙條對檢測儀器及操作人員要求不高，費用低廉、操作簡單，檢測費用僅為20元左右，15 min即可出結(jié)果，能滿足基層社區(qū)醫(yī)院的需求。本研究建立了一種精密性好、簡便、檢測范圍寬、能滿足床旁快速定量檢測的 CA19-9熒光免疫層析檢測方法，具有潛在的臨床應(yīng)用價值。進(jìn)一步研究將增加 CA19-9熒光免疫層析試紙條的生產(chǎn)批次，加大檢測的樣本數(shù)量，為其應(yīng)用于臨床打下基礎(chǔ)。

REFERENCES

[1]Koprowski H, Steplewski Z, Mitchell K, et al.Colorectal carcinoma antigens detected by hybridoma antibodies. Somatic Cell Genet, 1979, 5(6): 957–971.

[2]Ni XG, Zhao P, Wang GQ. The clinical value of serum CA19-9 in the diagnosis and prognosis of pancreatic cancer. J Clin Exp Med, 2008, 45(5): 14–15(in Chinese).倪曉光, 趙平, 王貴齊. 血清腫瘤標(biāo)志物CA19-9在胰腺癌診斷和預(yù)后中的價值. 臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志,2008, 45(5): 14–15.

[3]Tempero MA, Uchida E, Takasaki H, et al.Relationship of carbohydrate antigen 19-9 and Lewis antigens in pancreatic cancer. Cancer Res, 1987,47(20): 5501–5503.

[4]Albert MB, Steinberg WM, Henry JP. Elevated serum levels of tumor marker CA19-9 in acute cholangitis.Digest Dis Sci, 1988, 33(10): 1223–1225.

[5]Kodera Y, Yamamura Y, Torii A, et al. The prognostic value of preoperative serum levels of CEA and CA19-9 in patients with gastric cancer. Am J Gastroenterol, 1996, 91(1): 49–53.

[6]Kochi M, Fujii M, Kanamori N, et al. Evaluation of serum CEA and CA19-9 levels as prognostic factors in patients with gastric cancer. Gastric Cancer, 2000,3(4): 177–186.

[7]Yan QF, Chen YL, Wang YZ. Development of a CA19-9 immunoradiometric assay. J Isot, 2007,20(1): 16–19 (in Chinese).燕強奮, 陳永利, 王衍真. CA19-9雙位點夾心免疫放射分析法的建立. 同位素, 2007, 20(1): 16–19.

[8]An XY. Evaluation of domestic CA19-9 chemiluminescence assay kits. J Jiangsu Univ: Med Sci, 2010, 20(4): 317–320 (in Chinese).安仙園. 國產(chǎn)CA19-9化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒的評價.江蘇大學(xué)學(xué)報: 醫(yī)學(xué)版, 2010, 20(4): 317–320.

[9]Kouri M, Pyrh?nen S, Kuusela P. Elevated CA19-9 as the most significant prognostic factor in advanced colorectal carcinoma. J Surg Oncol, 1992, 49(2):78–85.

[10]Li FH, Wang XD, Xiang X. Clinical value of serum CA199 assays in the diagnosis of alimentary canal malignancy. Chin J Med Guide, 2013, 15(5):876–878 (in Chinese).李鳳煥, 王曉東, 向鑫. 消化道惡性腫瘤血清CA199檢測的臨床意義. 中國醫(yī)藥導(dǎo)刊, 2013,15(5): 876–878.

[11]Qin W. Detection of CA19-9 for the diagnosis of early pancreatic cancer. Chin J Clin Oncology Rehabilitation, 2013, 20(4): 385–386 (in Chinese).秦偉. 糖類抗原CA19-9診斷早期胰腺癌的效果觀察. 中國腫瘤臨床與康復(fù), 2013, 20(4): 385–386.

[12]Morita S, Nomura T, Fukushima Y, et al. Does serum CA19-9 play a practical role in the management of patients with colorectal cancer? Dis Colon Rectum,2004, 47(2): 227–232.

[13]Wang YL, Tang QY, Chen XY. Practical Diagnostic Techniques of Immunodiagnostics. Beijing: China Ocean Press, 2009: 79–180 (in Chinese).王云龍, 唐秋艷, 陳興業(yè). 免疫診斷試劑實用技術(shù). 北京: 海洋出版社, 2009: 79–180.

[14]Yang YJ. Fluorescent microspheres immunochromatographic assays for rapid detection of prealbumin and bone alkaline phosphatase[D].Nanchang: Nanchang University, 2016 (in Chinese).楊亞杰. 熒光免疫層析法快速定量檢測前白蛋白和骨特異性堿性磷酸酶[D]. 南昌: 南昌大學(xué),2016.

[15]Zhu L, Zhou Y, Huang B, et al. Establishment of a TRFIA-POCT for FER antibody and its clinical applecanon. Curr Immunol, 2016(1): 50–53 (in Chinese).朱嵐, 周衍, 黃飚, 等. 鐵蛋白時間分辨熒光免疫層析法的建立及臨床應(yīng)用. 現(xiàn)代免疫學(xué), 2016(1):50–53.

[16]Wang Q, Sheng SL, Huang G. Development of TRFIA for CA19-9 and effect of EDTA on CA19-9 measurement. Labeled Immun Clin Med, 2007,14(2): 100–102 (in Chinese).王青, 盛世樂, 黃鋼. CA19-9時間分辨熒光免疫分析方法建立及 EDTA處理血漿對其測定結(jié)果的影響. 標(biāo)記免疫分析與臨床, 2007, 14(2): 100–102.

[17]Huang B, Xiao HL, Zhu LG, et al. Study and application of time-resolved fluoroimmunoassay of CA19-9. Labeled Immun Clin Med, 2001, 8(1):25–27 (in Chinese).黃飚, 肖華龍, 朱利國, 等. CA19-9時間分辨熒光免疫分析方法的建立及應(yīng)用. 標(biāo)記免疫分析與臨床, 2001, 8(1): 25–27.

[18]Jiang NH, Chang WW, Tang S, et al. Preparation and test of test strip for quantitative detection of tumor markers: China, CN201610105566.X. 2017-09-01(in Chinese).蔣能輝, 常文偉, 唐盛, 等. 定量檢測腫瘤標(biāo)志物的試紙、制備方法及檢測方法: 中國,CN201610105566.X. 2017-09-01.