邵 婕 柴龍會 王伯駒 曲俐俐 肖向紅

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

東北林蛙(Rana dybowskii)屬蛙科(Ranidae)、林蛙屬，在我國主要分布于東北三省和內(nèi)蒙古的東北部［1］。由于人為大量捕殺，以及生境喪失、氣候變遷、紫外線－β輻射、外來入侵物種、污染、疾病和免疫系統(tǒng)破壞等致危因素的影響，導(dǎo)致其野生數(shù)量銳減，已經(jīng)被列入《世界瀕危動物紅皮書》保護級別Ⅱ級，為易危(V)物種［2］。

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，Ah)隸屬于弧菌科(Vibrionaceae)、氣單胞菌屬，是一種廣泛分布在水生環(huán)境可感染多種動物和人類的革蘭氏陰性菌，能夠引起以蛙紅腿和皮膚潰爛壞死為特征的敗血性細菌性傳染?。?－4］。本研究對黑龍江省伊春林區(qū)患病東北林蛙肝臟、腹腔積液中的病原菌分離純化，得到一優(yōu)勢菌株RY－1，并對該菌株進行分子生物學(xué)鑒定，人工感染嗜水氣單胞菌后觀察東北林蛙肝臟組織病理學(xué)變化，以期對東北林蛙細菌疾病的控制以及免疫功能的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及主要試劑

患病東北林蛙，于2016年9月采自黑龍江省伊春林區(qū)，2～3齡，體質(zhì)量(18.74±0.81)g;細菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司);健康東北林蛙取自同一地區(qū)，體質(zhì)量(20±2)g;微量生化發(fā)酵管(杭州天河微生物試劑有限公司);DNA純化回收試劑盒(天根生化科技有限公司)。

1.2 菌種分離

無菌條件下取病蛙肝臟(勻漿)、腹腔積液，接種于LB培養(yǎng)基，28℃、18 h培養(yǎng)，細菌分離，挑取優(yōu)勢單菌落培養(yǎng)，獲得單一菌株，編號為RY－1，4℃保存。

1.3 細菌形態(tài)特征觀察和理化特性檢查

將菌株RY-1進行革蘭氏染色，同時將其接種于TSA平板培養(yǎng)基和血平板，28℃、24 h后觀察其生長。將菌株RY-1接種于細菌理化特性反應(yīng)管中，參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［5］進行細菌生理生化測定。

1.4 細菌的分子鑒定

1.4.1 模板的制備

按照細菌基因組DNA提取試劑盒方法提取菌株RY-1基因組DNA，并保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 16S rDNA基因的PCR擴增、測序及同源性分析

16S rDNA基因擴增的兩個引物分別為27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR產(chǎn)物電泳檢測為預(yù)期目的條帶后，純化，按照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒使用說明書進行PCR產(chǎn)物的回收，將PCR回收產(chǎn)物送至公司進行測序。將菌株RY-1的16S rDNA基因序列通過NCBI Blast系統(tǒng)進行比對，用MEGA3.1軟件進行序列同源性分析，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4.3 菌株濃度測定

無菌接種環(huán)從試管斜面上取一環(huán)菌液，在LB培養(yǎng)基上平板劃線18 h，挑取單一、中央凸起、呈淡黃色有光澤的圓形菌落于2 mL液體培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。將菌液以1∶100接入至LB液體培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，每個時間點取6組菌液測OD值并求其平均值，用平板涂布的方法［6］進行菌落計數(shù)。

1.4.4 人工感染東北林蛙

健康東北林蛙，隨機分2組(實驗組、對照組)，每組12只，淋巴囊注射，實驗組注射對數(shù)生長期菌液1 mL、對照組注射1 mL LB。

1.4.5 肝臟組織病理學(xué)

分別取感染后12 h、24 h、48 h、72 h的蛙肝臟，組織切片，常規(guī)HE染色組織病理學(xué)觀察。

1.4.6 分離鑒定致病菌

取人工感染的東北林蛙的肝組織(勻漿)、腹腔積液接種至LB培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)過夜，挑選優(yōu)勢菌落分離純化，轉(zhuǎn)接至血平板、TSA培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，通過對菌落的形態(tài)觀察、生理生化鑒定、16S rDNA、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建等方法，再次對該菌落分析鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)特征

菌株RY-1培養(yǎng)24 h后觀察，其特征為表面光滑、邊緣整齊、中央凸起的淡黃色圓形菌落，有芳香氣味，β溶血陽性。革蘭氏染色呈兩端鈍圓的陰性短桿菌。

2.2 病原菌生理生化特性

結(jié)果顯示，菌株RY-1發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣;分解賴氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶;利用葡萄糖、麥芽糖、甘露醇等;不利用乳糖、山梨醇、山梨糖、肌醇等(表1)。

表1 病原菌生理生化實驗結(jié)果Tab.1 Results of physiological and biochemical experiments of pathogenic bacteria

2.3 16S rDNA結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株RY-1擴增的16S rDNA基因序列長度為1407 bp(圖1)，同源性分析均與氣單胞菌屬細菌的16S rDNA基因序列自然聚類，RY-1菌株與NCBI Blast系統(tǒng)檢索出的嗜水氣單胞菌(登錄號KY694995.1)聚為一支，與其相似性最近的一支為100%(圖2)。

基于上述RY-1的表型特征、理化特性及16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹等結(jié)果的綜合分析，判定該菌株為氣單胞菌屬(Aeromonas)的嗜水氣單胞菌(A．hydrophila)。

圖1 16S rDNA PCR擴增結(jié)果Fig.1 16S rDNA PCR amplification results

圖2 基于16S r DNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

2.4 OD值與濃度相關(guān)性

菌株RY-1的對數(shù)生長期為5～7.5 h，在7.5 h峰值的細菌活性為9.0×1015CFU/mL，穩(wěn)定期不明顯(表2)。

表2 嗜水氣單胞菌生長培養(yǎng)OD值與濃度Tab.2 The growth culture OD value and concentration of hydro-cytoplasm

2.5 人工感染Ah后林蛙病理學(xué)變化

Ah組淋巴囊注射，濃度為9.0×1015CFU/mL，LB組注射等量LB液體培養(yǎng)基。Ah侵染12 h后東北林蛙表現(xiàn)為運動遲緩、趾部紅腫并逐步蔓延至腿部。解剖學(xué)觀察:腹腔積水，肝臟、腎臟、肺部充血腫脹。

肝臟組織病理學(xué)觀察:LB組12 h未出現(xiàn)明顯病變(圖3－A);24 h肝竇擴張、瘀血(圖3－B);48 h肝細胞排列紊亂，細胞質(zhì)疏松(圖3－C);72 h細胞間隙增大(圖3－D)，而健康蛙肝細胞排列緊密，圓形或橢圓形(圖3－E)。Ah組肝組織在12 h肝竇擴張、瘀血，竇腔內(nèi)充滿完全溶解的紅細胞碎片(圖4－A1);24 h部分細胞核破裂溶解，細胞之間界限不清，呈空泡樣變，血管和肝細胞不易區(qū)分(圖4－B1);48 h肝組織中央靜脈擴張，局部有空泡，細胞核破裂溶解，炎性細胞浸潤明顯(圖4－C1);72 h肝細胞破裂，細胞核固縮、破裂溶解，肝組織出現(xiàn)廣泛性炎癥出血，完整細胞難以見到，這種破壞尤以中央靜脈周圍為甚(圖4－D1)。

圖3 未感染的東北林蛙肝臟組織病理學(xué)變化Fig.3 Histopathological changes of the liver tissues of the uninfected Rana dybowskii

圖4 人工感染后東北林蛙肝臟組織病理學(xué)變化Fig.4 Histopathological changes of the liver in the Rana dybowskii after artificial infection

2.6 人工感染菌分離鑒定

從RY-1人工感染的東北林蛙肝臟中分離獲得菌株，革蘭氏染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其在形態(tài)特征上同原感染菌相同，細菌學(xué)特征鑒定其性狀與原菌株一致。

3 討論

嗜水氣單胞菌對兩棲類有強致病性［7］。本實驗從病蛙體內(nèi)分離獲得一菌株RY-1，其特征表現(xiàn)為氧化酶陽性，革蘭氏陰性，蔗糖、鳥氨酸脫羧酶陽性，分解葡萄糖產(chǎn)氣，并發(fā)酵阿拉伯糖、甘露醇、七葉苷，參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》進行種類鑒定，初步鑒定RY-1為嗜水氣單胞菌。由于16S rDNA在進化上高度保守，本研究獲得的菌株RY-1的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的嗜水氣單胞菌(登錄號KY694995.1)16S rDNA相似性為100%，系統(tǒng)進化樹也進一步顯示RY-1與嗜水氣單胞菌各菌株聚為一簇，從而進一步證明這一菌株為嗜水氣單胞菌。Huys［8］等從患有敗血癥的虎紋蛙(Rana rugulosa)中分離到的致病菌經(jīng)鑒定也是Ah，說明Ah是蛙類易感致病菌。

Schadich［9］等研究表明棕樹蛙(Litoria ewingii) 致命性皮膚病與嗜水氣單胞菌、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)，奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)的爆發(fā)相關(guān)，Hill［10］等研究發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌感染非洲爪蟾(Xenopus laevis)，可導(dǎo)致彌漫性肺炎和纖維性腦膜炎，其臨床病變包括唇部、前肢胸腹部的皮膚潰爛，肝臟病灶出現(xiàn)纖維蛋白和炎性細胞。本研究觀察到患病東北林蛙腹部脹氣，頭部、口周、腹部、背部及腿部呈大小不等潰爛和出血點，剖檢可見腹水，肝、脾、腎腫大等細菌性感染的病理特征。組織學(xué)觀察病蛙肝臟中央靜脈擴大，早期出現(xiàn)炎性細胞浸潤，肝索結(jié)構(gòu)紊亂，細胞核固縮，72 h肝組織出現(xiàn)廣泛性出血，細胞溶解，以上可以表明嗜水氣單胞菌對于東北林蛙具有較強的致病性。

［1］ 謝鋒，葉昌媛，費梁，等．中國東北地區(qū)林蛙屬物種的分類學(xué)研究(兩棲綱:蛙科)［J］．動物分類學(xué)報，1999，24(2):224－231．

［2］ 江建平，謝鋒，臧春鑫，等．中國兩棲動物受威脅現(xiàn)狀評估［J］．生物多樣性，2016，24(5):588－597．

［3］ 于學(xué)輝，王遠微，湯承，等．嗜水氣單胞菌的研究進展 ［J］．西南民族大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2007，33(3):507－514．

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［5］ 東秀珠，蔡妙英．常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊 ［M］．北京:科學(xué)出版社，2001．

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［7］ Mourino J L P，Martins M L，Yamashita M M，et al．Isolamento de Aeromonas hydrophila em girinos de ra-touro na metamorfose ［J］．Pesquisa Agropecuária Brasileira，2006，41(8):1325 －1327．

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