楊軍 王艷菊 白永文 張江榮

摘 要：瑪咖中含有多種大量的瑪咖酰胺，不同瑪咖酰胺具有不同的作用，將其有效分離并應(yīng)用于不同領(lǐng)域是發(fā)揮瑪咖作用的主要途徑。工業(yè)生產(chǎn)研究過程中曾嘗試多種不同的方法，但是不同的分離方法均具有不同的優(yōu)劣勢，應(yīng)用效果欠佳。本文主要就高效液相色譜法分離5種瑪咖酰胺的基本情況進(jìn)行了分析。

關(guān)鍵詞：瑪咖酰胺；高效液相色譜法；含量檢測

中圖分類號：S567.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20180432013

瑪咖主要產(chǎn)于云南迪慶、麗江等高原地區(qū)，是一種非常獨特的高原農(nóng)作物，具有增強(qiáng)體力、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老的功能，是近些年來發(fā)現(xiàn)并廣泛應(yīng)用的營養(yǎng)保健產(chǎn)品?，斂е泻写罅坑袃r值成分，包括蛋白質(zhì)、維生素、氨基酸、瑪咖烯及瑪咖酰胺等，其中瑪咖酰胺是最為主要的功能成分，其含量的高低是決定瑪咖價值的關(guān)鍵因素，如何將瑪咖酰胺從瑪咖中分離出來、選擇何種安全且高效的分離方法是當(dāng)前生產(chǎn)研究面臨的重大難題。

1 高效液相色譜法分離瑪咖酰胺實驗過程

1.1 實驗儀器與試劑

儀器主要有島津LC-20A高效液相色譜儀-配置紫外檢測器、RE 2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、FRQ-1004DHT型超聲清洗器、TDL-40C型低速臺式大容量離心機(jī)等。

試劑主要有間甲氧基-芐基-亞麻酰胺、芐基-亞麻酰胺、間甲氧基-芐基-亞油酰胺、芐基-亞油酰胺、芐基-十六烷酰胺5種瑪咖酰胺對照品（純度98%以上），乙腈（色譜純），甲酸（色譜純，美國天地有限公司），石油醚（分析純，沸程60～90℃）。

1.2 液相色譜條件

Waters XTerra C18（規(guī)格為250mm×4.6mm，5μm）色譜柱，保持柱溫30℃，乙腈：0.2%甲酸水90：10，等度洗脫，流動相流速1.0 mL/min，紫外檢測波長 210nm，單次進(jìn)樣量10μL。

1.3 液相質(zhì)譜聯(lián)用條件

選擇電噴霧離子源ESI，采用正負(fù)離子進(jìn)行掃描，將毛細(xì)管電壓維持在4500V，選擇氮氣為干燥氣體流量為15L/min，去溶劑溫度為250℃，維持0.7MPa的噴霧器壓力，進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測。

1.4 對照品溶液的制備

利用分析天平稱取適量的5種瑪咖酰胺對照品將其置于250mL的容量瓶中，選擇配比好的乙腈溶液溶解后定容，然后從每份制備好的對照品分別取1.0mL、0.8mL、0.6mL、0.4mL、0.2mL及0.1mL的溶液，置于10mL容量瓶中，選用乙腈溶液進(jìn)行定容，搖勻后共得到30種不同濃度、不同種類的瑪咖酰胺對照品溶液。

1.5 樣品溶液的準(zhǔn)備

選擇市面上常見的瑪咖干制品，粉碎后過50目篩，備用。利用電子天平精密稱取粉末1.5g，置于50mL的圓底燒瓶中，加入50.0mL石油醚（保證瑪咖粉末能夠完全浸沒于石油醚中），將圓底燒瓶置于合適大小的電熱套中，安裝回流管回流提取約6h，將提取液和瑪咖渣一同倒入50mL離心管中，5000rpm離心10min。將上清液進(jìn)行旋蒸，使石油醚與瑪咖酰胺進(jìn)行分離，選用乙腈溶液將提取物溶解定容至5mL，并利用0.22μm一次性過濾器進(jìn)行過濾，得到5種瑪咖酰胺的樣品提取物。

2 條件優(yōu)化和方法評價

2.1 色譜條件優(yōu)化

對比不同流動相下瑪咖酰胺的分離效果，當(dāng)選擇乙腈-水作為洗脫相時，瑪咖酰胺分離效果的最佳，而在洗脫液中添加0.2%的甲酸溶液會得到較為對稱瑪咖酰胺質(zhì)譜峰型，因此應(yīng)當(dāng)選擇乙腈-水（0.2%甲酸溶液）作為首選洗脫溶液。

2.2 紫外檢測波長的選擇

針對不同波長下的瑪咖酰胺光譜情況進(jìn)行選擇，當(dāng)波長在200nm時瑪咖酰胺的響應(yīng)強(qiáng)度較高，但是基線漂移現(xiàn)象較為嚴(yán)重，因此210nm紫外光線下檢測光譜效果最佳。

2.3 柱溫及流速條件

經(jīng)過多次試驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)柱溫在30℃，洗脫液流速維持1.0mL/min時，5種種類的瑪咖酰胺才能完全實現(xiàn)基線分離，在光譜上完全展示出來，而且能夠有效縮短瑪咖酰胺分離的時間，避免長時間的分離過程中瑪咖酰胺溶解于洗脫液中，影響其含量及純度。

2.4 方法學(xué)考察

當(dāng)所有檢測分離條件完成優(yōu)化后，選擇混合對照品溶液，按照最佳的色譜條件進(jìn)行測定，分析對照品溶度與峰面積之間的線性關(guān)系，并將對照品溶液按照不同的信噪比進(jìn)行稀釋，確定其檢出限和定量限。

2.5 精密度實驗

將不同種類的瑪咖酰胺對照品溶液選擇高、中、低3種濃度，在同樣的色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣6次，將不同時間段進(jìn)樣得到的實驗結(jié)果進(jìn)行比較，比較峰面積的大小，若是5種瑪咖酰胺不同濃度點RSD下于1.0%，則說明瑪咖酰胺提取物純度較高，采用的分離檢測方法效果顯著，精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗

通過穩(wěn)定性試驗來檢驗利用高效液相色譜法分離的效果，將提取的瑪咖酰胺溶液連續(xù)3d，在同樣色譜條件下進(jìn)樣檢測3次，分析比較不同時間的峰面積，當(dāng)面積差異小于0.5%時說明提取物穩(wěn)定性良好。

2.7 回收實驗

利用電子天平精密稱取已知含量的同一批次瑪咖樣品1g，樣品處理后按高中低3個水平分別加入對照品。進(jìn)樣分析，每個樣品重復(fù)3次，計算峰面積的RSD。

3 實驗結(jié)果

3.1 瑪咖酰胺提取物的紫外色譜圖

瑪咖酰胺提取物在210nm色譜條件下，得到圖1，色譜條件與上文中列出的條件相同。

瑪咖酰胺提取物的色譜出峰順序及時間為間甲氧基-芐基-亞麻酰胺15.003min，芐基-亞麻酰胺15.659min，間甲氧基-芐基-亞油酰胺19.846min，芐基-亞油酰胺20.828min，芐基-十六烷酰胺28.022min。

3.2 5種瑪咖酰胺線性關(guān)系、檢測限和定量限分析結(jié)果詳見表1。

3.3 5種瑪咖酰胺的回收率和準(zhǔn)確度結(jié)果詳見表2。

4 結(jié)語

本文主要分析了利用高效液相色譜法分離瑪咖中5種瑪咖酰胺的效果，方法操作簡便、分離效果良好，同時利用質(zhì)譜驗證方法確定了5種瑪咖酰胺的類型，根據(jù)色譜特點和質(zhì)譜特點能夠有效判斷瑪咖酰胺的結(jié)構(gòu)類型；同時本研究采用方法學(xué)考察、精密度實驗等多種方法驗證了高效液相色譜分離法的價值，實驗結(jié)果表明高效液相色譜分離法應(yīng)用價值高，廣泛應(yīng)用于瑪咖產(chǎn)品質(zhì)量的檢測中，該方法具有操作簡便、準(zhǔn)確性高、高效安全的特點。

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