吳異蘭，王晗

（1. 福建中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院，福建福州350122；2. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤科，福建福州350001）

在中國(guó)，肺癌的發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤的首位[1]，其中80%以上為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，70%左右的NSCLC患者在就診時(shí)已失去了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，化療是治療晚期NSCLC的主要手段。紫杉醇是治療NSCLC的有效藥物之一[2]，但其療效受到耐藥問(wèn)題的影響[3]。白藜蘆醇(resveratrol，Res)不但能對(duì)人類的鼻咽癌、肺癌、食管癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、乳腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、表皮癌及白血病等多種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用[4-7]，還可通過(guò)誘導(dǎo)凋亡增強(qiáng)耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[8]。但白藜蘆醇對(duì)肺癌紫杉醇耐藥性的作用國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道，本研究通過(guò)建立人肺腺癌紫杉醇耐藥細(xì)胞A549/Taxol-R，觀察白藜蘆醇作用后A549/Taxol-R細(xì)胞對(duì)紫杉醇敏感性的改變，并檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，探討白藜蘆醇影響A549/Taxol-R細(xì)胞紫杉醇敏感性的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

人肺腺癌細(xì)胞A549，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；白藜蘆醇(98%，HPLC)購(gòu)于西安賽德公司，紫杉醇購(gòu)于美國(guó)百時(shí)美施貴寶公司，Ham’s F12培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于美國(guó)HyClone公司，DMSO、MTT購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購(gòu)于凱基生物公司，細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板購(gòu)于美國(guó)Corning公司，兔抗人 β-actin單抗、兔抗人Caspase-3 單抗、兔抗人Bcl-2單抗、兔抗人Bax單抗購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司，羊抗兔二抗購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 人肺腺癌紫杉醇耐藥細(xì)胞A549/Taxol-R的構(gòu)建在含有10%胎牛血清的 H am’s F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)人肺腺癌細(xì)胞A549，并置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中備用。參考Sun等[9]的方法，用含有低濃度紫杉醇(初始濃度為10ng/mL)的培養(yǎng)液干預(yù)細(xì)胞，在濃度遞增的作用下，連續(xù)培養(yǎng)10個(gè)月，直到細(xì)胞能于含紫杉醇的培養(yǎng)液中長(zhǎng)期穩(wěn)定生長(zhǎng)后將細(xì)胞凍存，2個(gè)月后復(fù)蘇，細(xì)胞仍維持在含紫杉醇培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長(zhǎng)的能力，初步構(gòu)建A549/Taxol-R細(xì)胞。

1.2.2 人肺腺癌紫杉醇耐藥株A549/Taxol-R的鑒定繪制A549/Taxol-R細(xì)胞和人肺腺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng)增殖曲線，并按Patterson公式計(jì)算二者不同的細(xì)胞群體倍增時(shí)間(doubling time， tD) ， tD= tC× lg2/(lgNt - lgNo)，其中 No指初始細(xì)胞數(shù)， Nt指終末細(xì)胞數(shù)， tC指培養(yǎng)的時(shí)間(h)。另用MTT藥敏實(shí)驗(yàn)計(jì)算A549/Taxol-R的耐藥指數(shù)(R I值)。 R I=I C50(A549/Taxol-R)/I C50(A549)。通過(guò)以上方法鑒定是否成功構(gòu)建A549/Taxol-R細(xì)胞。

1.2.3 MTT法將A549/Taxol-R細(xì)胞懸液按5×104/mL分別等量接種于96孔板，將培養(yǎng)板置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后更換含不同濃度(5、10、20、50、100、200μmol/L)白藜蘆醇的培養(yǎng)基，每個(gè)濃度再分為3組，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。測(cè)定時(shí)間點(diǎn)分別為繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h后，同時(shí)以DMSO為對(duì)照組。在各組測(cè)定時(shí)間點(diǎn)每孔加入5mg/mL的MTT20 μL，繼續(xù)孵育4h，吸棄培養(yǎng)液加入DMSO，在酶標(biāo)儀上測(cè)定其在490nm處的吸光度 D (490)值，取其平均值計(jì)算細(xì)胞抑制率，觀察白藜蘆醇對(duì)A549/Taxol-R細(xì)胞的影響。細(xì)胞存活率=[D( 4 90)實(shí)驗(yàn)組/ D(490)對(duì)照組]×100%；細(xì)胞抑制率=[1-D( 4 90)實(shí)驗(yàn)組/ D(490)對(duì)照組]×100%。用上述方法備板及MTT方法觀察不同濃度(5、10、20、50、100μmol/L)白藜蘆醇處理A549/Taxol-R 細(xì)胞24h后，紫杉醇對(duì)各處理組細(xì)胞的 IC50，判斷白藜蘆醇對(duì)A549/Taxol-R細(xì)胞紫杉醇敏感性的影響。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)分為4組，分別為空白對(duì)照組、20μmol/L白藜蘆醇組、2.5μg/mL紫杉醇組、2.5μg/mL紫杉醇+20μmol/L白藜蘆醇聯(lián)合組。分別處理A549/Taxol-R細(xì)胞24h后用0.25%胰酶消化細(xì)胞，800r/min離心5min，棄上清液后用預(yù)冷的4℃ PBS洗滌細(xì)胞2次，充分去除胰酶和EDTA的干擾，重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至約1×106/mL，按照說(shuō)明用無(wú)染色細(xì)胞為存活細(xì)胞，Annexin V-FITC/PI試劑盒進(jìn)行染色。室溫下避光孵育15min，加入Bingding Buffer，上機(jī)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀：無(wú)染色細(xì)胞為存活細(xì)胞，Annexin V單染細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞，Annexin V、PI雙染細(xì)胞為晚期凋亡或壞死細(xì)胞，PI單染細(xì)胞為機(jī)械性損傷細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程誤差)。

1.2.5 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3的表達(dá)實(shí)驗(yàn)分組同1.2.4，分別處理A549/Taxol-R細(xì)胞24h后，收集細(xì)胞，提取總蛋白，BCA試劑盒定量。上樣同樣質(zhì)量總蛋白后電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗4℃振搖孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育2h后用ECL顯色系統(tǒng)顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描曝光后的膠片，用ImageJ軟件分析圖片中條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以表示，多組之間均數(shù)比較使用單因素方差分析，MTT試驗(yàn)中 IC50值(95%可信區(qū)間)使用Probit回歸分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建人肺腺癌紫杉醇耐藥株A549/Taxol-R

體外細(xì)胞生長(zhǎng)增殖曲線顯示，A549/Taxol-R細(xì)胞較其親本細(xì)胞增殖速度有所減慢，細(xì)胞群體倍增時(shí)間有所延長(zhǎng)，由(31.66±0.57)h增加到(36.46±1.09)h，但仍符合腫瘤細(xì)胞增殖特征。經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)得紫杉醇對(duì)A549的 IC50為(1.58±0.45)μg/mL，紫杉醇對(duì)A549/Taxol-R的 IC50為(18.00±4.71)μg/mL， R I值為11.4，屬于中度耐藥[10]，符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 白藜蘆醇不同濃度和干預(yù)時(shí)間對(duì)A549/Taxol-R細(xì)胞抑制率的影響

MTT試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，可見(jiàn)隨著濃度的提高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，白藜蘆醇對(duì)A549/Taxol-R細(xì)胞的抑制率上升，白藜蘆醇對(duì)A549/Taxol-R細(xì)胞的抑制率具有濃度效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)(P均<0.05)。白藜蘆醇3個(gè)不同干預(yù)時(shí)間(24、48和72h)對(duì)A549/Taxol-R細(xì)胞的 IC50值分別為55.7、39.2、29.5μmol/L。

圖1 不同時(shí)間和濃度的白藜蘆醇對(duì) A 549/Taxol-R細(xì)胞的影響

2.3 白藜蘆醇提高A549/Taxol-R細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性

MTT檢測(cè)結(jié)果(圖2)顯示，隨著白藜蘆醇濃度的提高 (5、 10、 20、 50、 100μmol/L)， 紫 杉 醇 對(duì) A549/Taxol-R細(xì)胞的IC50值下降，分別為(17.50±1.24)、(13.40±1.12)、(9.39±0.97)、(6.36±0.80)和(4.18±0.62)μg/mL，即A549/Taxol-R細(xì)胞對(duì)紫杉醇敏感性上升。

圖2 紫杉醇對(duì)不同濃度白藜蘆醇處理組 A 549/Taxol-R細(xì)胞的IC50

2.4 白藜蘆醇和紫杉醇聯(lián)合干預(yù)對(duì)A549/Taxol-R細(xì)胞凋亡的影響

根據(jù)2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇2.5μg/mL的紫杉醇和20 μmol/L的白藜蘆醇用于后續(xù)細(xì)胞凋亡研究。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1，由儀器自動(dòng)計(jì)數(shù)細(xì)胞得出各亞群細(xì)胞比例，依照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀。白藜蘆醇和紫杉醇聯(lián)合干預(yù)組的A549/Taxol-R早期凋亡率、晚期凋亡率+壞死率均高于紫杉醇單獨(dú)干預(yù)組，白藜蘆醇和紫杉醇聯(lián)合干預(yù)組的細(xì)胞存活率低于紫杉醇單獨(dú)干預(yù)組(P 均<0.05)。

表1 白藜蘆醇-和紫杉醇聯(lián)合干預(yù)對(duì) A 549/Taxol-R細(xì)胞凋亡率和壞死率的影響(%，x±s)

2.5 白藜蘆醇和紫杉醇聯(lián)合干預(yù)對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3的表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，白藜蘆醇和紫杉醇聯(lián)合處理組與單獨(dú)使用紫杉醇組相比，Bax、Caspase-3的表達(dá)明顯上調(diào)，而B(niǎo)cl-2的表達(dá)明顯下調(diào)。見(jiàn)圖3和表2。

圖3 凋亡相關(guān)蛋白 B ax、 B cl-2 和C aspase-3的表達(dá)

3 討論

目前有大量研究表明白藜蘆醇可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡[11]，并通過(guò)抑制細(xì)胞色素P450酶、誘導(dǎo)解毒酶、抑制環(huán)氧酶2、干擾細(xì)胞周期、抑制血管合成、抗核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和分化等途徑對(duì)腫瘤的起始、促進(jìn)和進(jìn)展3個(gè)階段起到抑制作用[12]。 因此可推測(cè)，白藜蘆醇可通過(guò)誘導(dǎo)A549/Taxol-R細(xì)胞凋亡逆轉(zhuǎn)其對(duì)紫杉醇的耐藥性，本研究進(jìn)一步證實(shí)了這一觀點(diǎn)。

Bcl-2家族、Caspase家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起到重要的作用。 B cl-2基因可以通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命來(lái)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[13]。Bcl-2的過(guò)表達(dá)可通過(guò)抑制細(xì)胞色素C等從線粒體的釋放來(lái)抑制Caspase-3 的活化，而Caspase-3同時(shí)又是Bcl-2的生理性蛋白酶[14]。Bax也屬于 B cl-2基因家族，是重要的促凋亡蛋白，未激活時(shí)存在于胞漿中，誘導(dǎo)凋亡時(shí)活化的Bax 移位至線粒體建立膜通道，促使線粒體釋放細(xì)胞色素C和其他的促凋亡因子，激活Caspase家族蛋白使細(xì)胞凋亡，Bcl-2基因則參與調(diào)控這一過(guò)程[15-16]。 B cl-2 基因與Bax基因表達(dá)產(chǎn)物的比例對(duì)于細(xì)胞最終是否進(jìn)入細(xì)胞凋亡程序極為重要，而Caspase-3則是細(xì)胞凋亡終末途徑的效應(yīng)蛋白，其活性受到兩者調(diào)控[17-18]。

課題組前期的體外研究也證明了白藜蘆醇不但能夠抑制胃癌細(xì)胞株的增殖[19]，而且能誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡[20]；體內(nèi)研究證實(shí)了白藜蘆醇能夠誘導(dǎo)裸鼠胃癌移植瘤細(xì)胞的凋亡作用，并且與上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2表達(dá)有關(guān)[21]。白藜蘆醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效應(yīng)也被證實(shí)受Caspase-3活性決定，同時(shí)還受到Bax、Bcl-2調(diào)控[21]。

本研究中觀察到 ， 白藜蘆醇和紫杉醇聯(lián)合干預(yù)組相較于單獨(dú)使用紫杉醇組，細(xì)胞的早期凋亡率、晚期凋亡率或壞死率均升高，其Bax、Caspase-3的表達(dá)明顯上調(diào)，而B(niǎo)cl-2的表達(dá)明顯下調(diào)。說(shuō)明白藜蘆醇可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞的凋亡及壞死來(lái)提高A549/Taxol-R細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性，其機(jī)制可能通過(guò)促進(jìn)Bax、Caspase-3的表達(dá)， 下調(diào)Bcl-2的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。

由于白藜蘆醇在植物中分布十分廣泛而且含量較高，故白藜蘆醇對(duì)非小細(xì)胞肺癌耐藥的影響作用研究，不但可望降低NSCLC的耐藥性，提高化療藥物的治療效果，節(jié)約醫(yī)療資源，提高人群的健康水平，同時(shí)也可促進(jìn)含白藜蘆醇的天然植物資源的開(kāi)發(fā)利用，其應(yīng)用和發(fā)展前景十分廣闊，具有良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

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