王英超，于 澤，王 鵬，馮婉玉

(北京大學(xué)人民醫(yī)院藥劑科，北京 100044)

苯海拉明乳膏是由鹽酸苯海拉明和二甲硅油石蠟乳膏組成的醫(yī)院制劑，主要作為抗過敏藥，用于治療過敏性皮膚病。長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐證實(shí)，該藥具有很好的療效，受到患者和醫(yī)師的普遍認(rèn)可。本研究采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測(cè)定苯海拉明乳膏中鹽酸苯海拉明的含量[1-4]，為該制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜系統(tǒng)，包括G1312A型二元輸液泵、G1329A型自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A型柱溫箱、G1379B型脫氣機(jī)及G1315D型檢測(cè)器(美國(guó)Agilent公司)；Mini-13 K型微型高速離心機(jī)(杭州奧盛儀器有限公司)；Vortex-Genie型渦旋儀(Scientific Industries公司)；GM-50過濾器(天津騰達(dá)過濾器件廠)；CPA225D型萬分之一天平(德國(guó)Sartorius公司)。

1.2 藥品與試劑

鹽酸苯海拉明對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100066-200807，純度≥99%)；苯海拉明乳膏(北京大學(xué)人民醫(yī)院；批準(zhǔn)文號(hào)：京藥制字H20064300；批號(hào)：171208)；甲醇、乙腈(HPLC級(jí)，F(xiàn)isher公司)；氨水(北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司，批號(hào)：20151009)；Direct-Q?超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Venusil XBP CN柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水-氨水(V∶V∶V=75 ∶25 ∶0.5)；檢測(cè)波長(zhǎng)：258 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：5 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 鹽酸苯海拉明標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱定鹽酸苯海拉明對(duì)照品0.1 g，置于100 ml容量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度并混勻，制得1 mg/ml的鹽酸苯海拉明儲(chǔ)備液。精密吸取1、2、4、6及8 ml置于10 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.4、0.6及0.8 mg/ml鹽酸苯海拉明標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.2 質(zhì)控樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱定鹽酸苯海拉明對(duì)照品0.01 g，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度并混勻，配制成1 mg/ml的鹽酸苯海拉明儲(chǔ)備液。精密吸取1、4 ml置于10 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.1、0.4 mg/ml鹽酸苯海拉明質(zhì)控樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.3 供試品溶液：精密稱取5%苯海拉明乳膏1 g(相當(dāng)于鹽酸苯海拉明50 mg)，置于100 ml燒杯中，加入甲醇40 ml，80 ℃水浴加熱10 min，攪拌，趁熱定量轉(zhuǎn)移至100 ml容量瓶中，放冷至室溫(25 ℃)，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，冰浴冷卻2 h以上，取出后迅速過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液進(jìn)樣分析。

2.2.4 陰性樣品溶液：按處方比例，配制不含鹽酸苯海拉明的制劑，再按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備即得。

2.3 方法專屬性試驗(yàn)

取空白溶劑(甲醇)、鹽酸苯海拉明對(duì)照品溶液(0.6 mg/ml)、供試品溶液(0.5 mg/ml)、鹽酸苯海拉明-二苯酮溶液(0.5 mg/ml)及陰性對(duì)照品溶液(空白基質(zhì))各5 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，空白溶劑和供試品中的輔料不干擾鹽酸苯海拉明的測(cè)定，方法專屬性良好，見圖1。

A.空白溶劑；B.鹽酸苯海拉明對(duì)照品溶液(0.6 mg/ml)；C.供試品溶液(0.5 mg/ml)；D.鹽酸苯海拉明-二苯酮溶液(0.5 mg/ml)；E.陰性對(duì)照溶液A. blank solvent; B. diphenhydramine hydrochloride reference solution (0.6 mg/ml); C. test solution (0.5 mg/ml); D. diphenhydramine hydrochloride-diphenylketone solution(0.5 mg/m); E. negative reference solution

2.4 線性關(guān)系考察

取質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8及1.0 mg/ml的鹽酸苯海拉明標(biāo)準(zhǔn)溶液5 μl進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以鹽酸苯海拉明的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，鹽酸苯海拉明的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，用加權(quán)最小二乘法(W=1/x2)進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。鹽酸苯海拉明的線性方程為Y=0.03X+24.96，R2=0.999 8；結(jié)果表明，鹽酸苯海拉明在0.1～1.0 mg/ml范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

取鹽酸苯海拉明低、中及高質(zhì)量濃度(0.1、0.4及1 mg/ml)質(zhì)控樣品溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，得日內(nèi)精密度；連續(xù)進(jìn)樣3 d，得日間精密度[5-6]。記錄鹽酸苯海拉明峰面積，結(jié)果顯示，RSD均<0.5%，表明方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱定鹽酸苯海拉明對(duì)照品0.043 4 g，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成0.434 mg/ml鹽酸苯海拉明對(duì)照品溶液，分別于0、2、4、8及24 h取5 μl進(jìn)樣分析，記錄鹽酸苯海拉明峰面積，結(jié)果RSD為0.25%，表明鹽酸苯海拉明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 絕對(duì)回收率試驗(yàn)

按照低、中及高質(zhì)量濃度分別精密稱取3份鹽酸苯海拉明原料藥，置于100 ml燒杯中，分別加入苯海拉明乳膏空白基質(zhì)1 g，加入40 ml甲醇，置于80 ℃水浴加熱10 min，攪拌，趁熱定量轉(zhuǎn)移至100 ml容量瓶中，放冷至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，冰浴冷卻2 h以上，取出后迅速過濾，取續(xù)濾液5 μl進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算平均回收率[7-8]。結(jié)果表明，低、中及高3個(gè)級(jí)別質(zhì)量濃度的絕對(duì)回收率在98.0%～102.0%范圍內(nèi)，符合要求，見表1。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取苯海拉明乳膏(批號(hào)：171208，標(biāo)示含量5%)1 g(相當(dāng)于鹽酸苯海拉明50 mg)，置于100 ml燒杯中，加入甲醇40 ml，置于80 ℃水浴加熱10 min，攪拌，趁熱定量轉(zhuǎn)移至100 ml容量瓶中，放冷至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，冰浴冷卻2 h以上，取出后迅速過濾，取續(xù)濾液5 μl進(jìn)樣分析，平行操作6份，記錄色譜圖[9-10]。結(jié)果顯示，RSD為0.43%，表明本方法重復(fù)性較好。

表1 絕對(duì)回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of absolute recovery test

3 討論

本研究比較了不同溶劑如水、甲醇、乙醇及其混合液對(duì)樣品溶解效果的影響[11-13]。結(jié)果顯示，單用水做溶劑時(shí)，樣品不溶；常溫條件下甲醇溶解效果不佳。因此，考慮采用以加熱的方式促進(jìn)本品在甲醇中溶解，并經(jīng)放冷迅速過濾，綜合效果較好。本研究考察了流動(dòng)相中水相與有機(jī)相的比例，結(jié)果顯示，二者比例為25 ∶75時(shí)，出峰時(shí)間較合適且不受雜峰干擾，而加入0.5%的氨水則可將峰形調(diào)至最佳[14-15]。

本研究建立的苯海拉明乳膏中鹽酸苯海拉明的含量測(cè)定方法準(zhǔn)確度較高，重現(xiàn)性較好，操作簡(jiǎn)便，為醫(yī)院制劑苯海拉明乳膏的質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。

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