陸松偉，駱錦前，虞慧華，陳方劍 （海軍軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院藥學(xué)部, 上海 200433）

復(fù)方苯海拉明乳膏是由鹽酸苯海拉明、醋酸地塞米松、樟腦、薄荷腦等制成，是長(zhǎng)海醫(yī)院院內(nèi)特色制劑，臨床使用多年，主治過敏性皮炎、接觸性皮炎及皮膚瘙癢癥等皮膚病，療效顯著。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅測(cè)定醋酸地塞米松含量，對(duì)反映藥效的鹽酸苯海拉明未建立質(zhì)控方法。本研究建立測(cè)定復(fù)方苯海拉明乳膏中鹽酸苯海拉明含量的HPLC法，為提高復(fù)方苯海拉明乳膏的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

島津高效液相色譜儀（包括LC-20AD 泵、SPD-M20A 二極管陣列檢測(cè)器、CBM-20A 控制器和LC solution 工作站，日本島津公司），XS205DU電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司），DL-720A 超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）等。

1.2 試劑和藥品

復(fù)方苯海拉明乳膏（規(guī)格：20 g：鹽酸苯海拉明200 mg 與醋酸地塞米松10 mg，長(zhǎng)海醫(yī)院藥學(xué)部自制，批號(hào)：201008、201104、201105）；鹽酸苯海拉明對(duì)照品（含量99.2%，啟東東岳藥業(yè)有限公司，批號(hào)：DH-201909101）；甲醇為色譜純，無水乙醇、磷酸均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為ACE5C18S/N-A66766 柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，英國(guó)ACE 公司）；流動(dòng)相為甲醇-水-三乙胺（70∶30∶0.67，用磷酸調(diào)pH 為6.5）；流速為1.0 ml/min；柱溫為室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；進(jìn)樣量為20 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液

精密稱取鹽酸苯海拉明對(duì)照品1.976 g，置100 ml量瓶中，加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為1.976 mg/ml 的鹽酸苯海拉明對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2 供試品溶液

精密稱取本品1 g（約相當(dāng)于鹽酸苯海拉明10 mg），置燒杯中，加甲醇約25 ml，置水浴上加熱，攪拌，使其溶解，再置冰浴中冷卻，濾過，濾液置100 ml 量瓶中，同法提取3 次，濾液并入量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液

按本品處方制備不含鹽酸苯海拉明的空白乳膏，再按供試品溶液制備方法制備成陰性對(duì)照溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各20 μl 進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，供試品溶液色譜圖中，在與對(duì)照品溶液色譜圖相同的保留時(shí)間上有相同的色譜峰，出峰時(shí)間為7.8 min, 理論塔板數(shù)按鹽酸苯海拉明峰計(jì)算大于8 000，與相鄰峰的分離度大于2.0；而陰性對(duì)照品在此處則無色譜峰，說明乳膏基質(zhì)及其他成分在此色譜條件下對(duì)鹽酸苯海拉明測(cè)定無干擾，表明方法專屬性良好，結(jié)果見圖1。

圖1 復(fù)方苯海拉明乳膏中鹽酸苯海拉明的HPLC 圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下鹽酸苯海拉明對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml 分別置50 ml 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到系列濃度為39.52、79.04、118.6、158.1、197.6 μg/ml 的鹽酸苯海拉明對(duì)照品溶液。精密吸取對(duì)照品系列溶液各20 μl，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：A=16 944C+14 047，r=0.999 7。結(jié)果表明，鹽酸苯海拉明在39.52～197.6 μg/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

2.5.1 日內(nèi)精密度

精密吸取“2.4”項(xiàng)下濃度為79.04 μg/ml 的對(duì)照品溶液20 μl，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，按峰面積計(jì)算鹽酸苯海拉明的日內(nèi)精密度為0.82%（n=6）。

2.5.2 日間精密度

精密吸取“2.4”項(xiàng)下濃度為79.04 μg/ml 的對(duì)照品溶液20 μl，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件每日測(cè)定1 次，連續(xù)測(cè)定5 d，記錄峰面積，計(jì)算日間精密度為1.08%（n=5）。表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)（201 008）樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，按含量測(cè)定方法測(cè)定，代入回歸方程計(jì)算含量，計(jì)算得到鹽酸苯海拉明的含量為100.2%，RSD 為0.78%（n=6），表明方法的重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、8 h 各進(jìn)樣1 次，記錄峰面積，計(jì)算得到鹽酸苯海拉明的RSD 為0.59%（n=5），表明供試品溶液在8 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱定9 份不含鹽酸苯海拉明的空白乳膏各1.0 g，置燒杯中，分別加入已知濃度的鹽酸苯海拉明對(duì)照品適量，加甲醇約25 ml，置水浴上加熱，攪拌，使其溶解，再置冰浴中冷卻，濾過，濾液置100 ml 量瓶中，同法提取3 次，濾液并入量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得相當(dāng)于標(biāo)示量的80%、100%、120%的模擬樣品各3 份，按含量測(cè)定方法測(cè)定，代入回歸方程計(jì)算含量，并計(jì)算樣品的回收率。結(jié)果為鹽酸苯海拉明的平均回收率100.5%（RSD=0.26%，n=9），見表1。

表1 復(fù)方苯海拉明乳膏加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 ( x±s，n=9)

2.9 樣品含量測(cè)定

取3 個(gè)批號(hào)的復(fù)方苯海拉明乳膏，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算鹽酸苯海拉明的含量分別為標(biāo)示量的101.3%、99.83%和99.62%，結(jié)果見表2。

表2 復(fù)方苯海拉明乳膏含量測(cè)定結(jié)果( ±s, n=3)x

3 討論

3.1 提取方法的確立

鹽酸苯海拉明測(cè)定的關(guān)鍵在于樣品中鹽酸苯海拉明的提取，鹽酸苯海拉明在水中極易溶解，在乙醇或三氯甲烷中易溶，熔點(diǎn)為167～171℃。本實(shí)驗(yàn)比較了不同溶劑如水、乙醇、甲醇及其混合液對(duì)樣品溶解效果的影響，結(jié)果顯示，用水為溶劑時(shí)，樣品不溶，而采用甲醇作為溶劑提取回收率高，且樣品溶液進(jìn)入色譜系統(tǒng)不會(huì)有不溶物質(zhì)析出。供試品為水包油型乳膏，其基質(zhì)在常溫下并不能充分溶解，本研究采用甲醇水浴加熱至80℃左右，使供試品中的基質(zhì)和鹽酸苯海拉明完全溶解，再通過冰浴冷卻除去乳膏劑中的基質(zhì)，減少對(duì)鹽酸苯海拉明的干擾和色譜柱的污染，從而獲得相對(duì)理想的結(jié)果。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[1-2]，將對(duì)照品溶液和供試品溶液在200～400 nm 進(jìn)行掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鹽酸苯海拉明對(duì)照品在258 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，但供試品在258 nm 波長(zhǎng)處受雜質(zhì)峰的影響較大，而230 nm 波長(zhǎng)處鹽酸苯海拉明不受雜質(zhì)、輔料和溶劑的干擾，因此選擇230 nm 作為其檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 流動(dòng)相的選擇

本研究在測(cè)定鹽酸苯海拉明時(shí),經(jīng)文獻(xiàn)檢索[3-7]和《中華人民共和國(guó)藥典》[8]的收載，對(duì)文獻(xiàn)和藥典中提到的各種流動(dòng)相分別進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，選用甲醇-水（70:30）作為流動(dòng)相時(shí)，分離度較好，且出峰時(shí)間適中，但苯海拉明為堿性藥物，色譜峰拖尾嚴(yán)重，加入三乙胺，可有效改善色譜峰峰型。

3.4 檢測(cè)方法的選擇

本實(shí)驗(yàn)旨在對(duì)原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提升，原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中已有醋酸地塞米松含量的測(cè)定方法，故本實(shí)驗(yàn)僅考察鹽酸苯海拉明的含量測(cè)定方法。