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        QuEChERS結(jié)合高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測速溶茶粉中八種農(nóng)藥殘留

        2018-06-14 08:06:32鮑鏖天裴少芬唐杏燕王曉霞邵增瑯
        食品與發(fā)酵工業(yè) 2018年5期
        關(guān)鍵詞:速溶茶離心管乙腈

        鮑鏖天,裴少芬,唐杏燕,王曉霞,邵增瑯

        (南京融點食品科技有限公司,江蘇 南京,211300)

        速溶茶粉是以茶葉或茶鮮葉為主要原料,經(jīng)過萃取、過濾、濃縮和干燥等工藝制成的茶葉深加工產(chǎn)品,由于具有沖調(diào)速溶、易與其他食品調(diào)配等特點,近年來取得了高速發(fā)展[1]。

        溫濕的茶園環(huán)境和較高的茶樹種植密度使得茶樹很容易滋生病蟲害,現(xiàn)階段以施用農(nóng)藥為主的防治措施又必然會帶來農(nóng)藥殘留問題[2]。以茶葉為原料生產(chǎn)速溶茶粉的過程中還會發(fā)生農(nóng)藥殘留富集現(xiàn)象。以茶葉為參照,歐盟等主要進(jìn)口國對速溶茶粉中的農(nóng)藥最高殘留限量(maximum residue limit,MRL)要求非常嚴(yán)苛,我國最新修訂的國標(biāo)中也針對茶葉新增了多種農(nóng)藥檢測項目[3-4]。但是目前針對速溶茶粉中農(nóng)藥殘留檢測的報道非常少。

        為了保證速溶茶粉的質(zhì)量安全和順利出口,必須建立起檢測速溶茶粉中農(nóng)藥殘留的方法。速溶茶粉中含有源于茶葉的多種成分(茶多酚、咖啡堿等)和加工過程中添加的多種輔料(檸檬酸、D-異抗壞血酸鈉等),基質(zhì)成分相比茶葉更加復(fù)雜。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)的高選擇性、高靈敏度等特點使其適于檢測基質(zhì)成分復(fù)雜樣品中的痕量農(nóng)藥殘留[5]。QuEChERS(quick, easy, cheap, effective, rugged, safe)方法是一種簡單、快速的樣品前處理技術(shù),近年來被廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留檢測[6]。2017年6月開始實施的GB 2763—2016針對茶葉增加了多項農(nóng)藥殘留檢測項目,其中克百威、內(nèi)吸磷、滅線磷、甲胺磷、辛硫磷、吡蚜酮、硫環(huán)磷、氯唑磷使用了LC-MS/MS方法進(jìn)行檢測[4]。本文采用QuEChERS方法對速溶茶粉進(jìn)行前處理,探索建立適合同時檢測速溶茶粉中這8種農(nóng)藥殘留的HPLC-MS/MS方法,以期實現(xiàn)對速溶茶粉中這8種農(nóng)藥殘留的準(zhǔn)確、快速檢測。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        NaCl、MgSO4(AR級),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;MgSO4、N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化碳黑(GCB):上海安譜實驗科技股份有限公司;乙腈、甲酸:LC-MS級,美國Sigma-Aldrich公司;尼龍有機相微孔濾膜:0.22 μm,德國C&B公司。

        克百威(carbofuran)、內(nèi)吸磷(demeton(o+s))、滅線磷(ethoprophos)、甲胺磷(methamidophos)、辛硫磷(phoxim)、吡蚜酮(pymetrozine)、硫環(huán)磷(phosfolan)和氯唑磷(isozofos)標(biāo)準(zhǔn)品:100 μg/mL,德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        AL204電子分析天平,梅特勒-托利多儀器上海有限公司;XW-80A旋渦混合儀,金壇希望科研儀器有限公司;RJ-TGL-1650臺式高速離心機,無錫瑞江分析儀器有限公司;明澈TM-D 24UV超純水系統(tǒng),美國Merck Millipore公司;1260-6420液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀,美國Agilent公司。

        1.3 實驗方法

        1.3.1 質(zhì)譜條件

        電噴霧離子源,正離子模式(ESI+);干燥氣(氮氣)流速和溫度分別為10 L/min和350 ℃;霧化氣壓力為;毛細(xì)管電壓為3 500 V。

        1.3.2 液相色譜條件

        色譜柱:Poroshell 120 EC-C18色譜柱(2.7 μm,3.0 mm×50 mm);柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:5 μL;流速:0.3 mL/min。

        流動相A:乙腈(含0.1%甲酸);流動相B:水(含0.1%甲酸)。

        梯度洗脫程序:0~2 min,10% A;2~3 min,10%~60% A;3~10 min,60% A;10~11 min,60%~90% A;11~15 min,90% A;15~16 min,90%~10% A;16~20 min,10% A。

        1.3.3 樣品前處理

        稱取1 g(精確至0.01 g)樣品于50 mL離心管中,加入5 mL去離子水和10 mL乙腈,旋渦振蕩3 min,加入2.5 g NaCl,旋渦振蕩2 min,10 000 r/min離心5 min。

        移取1 000 μL上層乙腈提取液加入到裝有150 mg MgSO4、50 mg PSA和50 mg GCB的2 mL離心管中,旋渦振蕩1 min,15 000 r/min離心5 min,移取200 μL凈化液至2 mL離心管中,加入800 μL超純水,旋渦振蕩1 min后過微孔濾膜備用。

        1.3.4 溶液配制

        混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:分別移取100 μL 100 μg/mL農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中,用乙腈定容,配制成1 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。4 ℃下避光保存。

        混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:移取100 μL混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于2 mL的離心管中,加入900 μL超純水,配制成100 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液;移取100 μL 100 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于2 mL離心管中,加入900 μL超純水,配制成10 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液?;旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

        溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作液:分別移取200 μL乙腈于2 mL離心管中,再移取相應(yīng)濃度和體積的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于各離心管中,加水至1 mL,旋渦振蕩1 min后過微孔濾膜,配制成0.2、0.5、1、5、10和50 ng/mL溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作液。

        基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液:分別移取200 μL空白基質(zhì)凈化液(按1.3.3提取、凈化)于2 mL離心管中,再移取相應(yīng)濃度和體積的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于各離心管中,加水至1 mL,旋渦振蕩1 min后過微孔濾膜,配制成0.2、0.5、1、5、10和50 ng/mL基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

        ESI+模式下,用全掃描、單離子監(jiān)測掃描和子離子掃描優(yōu)化各化合物母離子的碎裂電壓(fragmentor)和子離子的碰撞能(collision energy,CE)。空白基質(zhì)進(jìn)樣,多重反應(yīng)監(jiān)測模式(multiple reaction monitoring,MRM)下發(fā)現(xiàn),在滅線磷243.1>173.0的離子通道上存在基質(zhì)干擾,在其他離子通道上均沒有基質(zhì)干擾。參考BOTERO-COY等檢測土壤中草甘膦時遇到基質(zhì)干擾時的試驗方法,雖然子離子173.0的響應(yīng)高于96.9的響應(yīng),但選擇沒有基質(zhì)干擾的243.1>96.9作為滅線磷的定性離子對[7]。其他7種化合物均選擇響應(yīng)最高的2個子離子作為定量和定性離子。優(yōu)化后的質(zhì)譜MRM參數(shù)見表1。

        表1 8種農(nóng)藥的MRM參數(shù)Table 1 The MRM parameters of the 8 kinds of pesticides

        注:*為定量離子。

        2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

        2.2.1 流動相的選擇

        為了減小溶劑效應(yīng),選擇與萃取溶劑相同的乙腈作為有機相[8]。ESI+模式下,在LC-MS/MS的流動相加入揮發(fā)性的酸可以提供H+,從而提高目標(biāo)化合物的離子化效率[6]。綜合考慮色譜柱的pH耐受范圍和目標(biāo)化合物的離子化效率,分別在有機相和水相中加入0.1%的甲酸。

        2.2.2 洗脫梯度的優(yōu)化

        吡蚜酮的提取離子流圖(extracted ion current,EIC)如圖1所示。在1~2 min有機相比例為5%的條件下,吡蚜酮的峰型發(fā)生裂分,表現(xiàn)出很強的溶劑效應(yīng)[8-9]。將1~2 min有機相比例提高到10%,吡蚜酮峰型裂分現(xiàn)象消失,峰型良好。8種農(nóng)藥的總離子流圖(total ion current,TIC)如圖2所示。由圖2可知,2~3 min有機相比例快速提高到60%后并維持7 min,8種農(nóng)藥在10 min內(nèi)全部出峰且基本分離開。質(zhì)譜檢測與色譜檢測不同,不需要通過色譜將各目標(biāo)化合物完全分離,但保證目標(biāo)化合物具備一定分離度可以減小基質(zhì)與目標(biāo)化合物共流出的概率,從而減小目標(biāo)化合物離子化時的基質(zhì)干擾[10]。

        圖1 吡蚜酮的提取離子流圖Fig.1 The EIC of the pymetrozine

        圖2 8種農(nóng)藥的總離子流圖Fig.2 The TIC of the 8 kinds of pesticides

        2.3 前處理條件的優(yōu)化

        2.3.1 鹽的選擇

        圖3 不同鹽對農(nóng)藥回收率的影響Fig.3 The influence of different salt on recoveries of pesticides

        2.3.2 凈化劑的選擇

        PSA可以顯著吸附茶葉中的茶多酚和葉綠素,GCB可以顯著吸附茶葉中的咖啡堿并凈化提取液的顏色[13]。在1.3.3的樣品前處理過程中分別加入150 mg MgSO4+50 mg PSA和150 mg MgSO4+50 mg PSA+50 mg GCB,試驗重復(fù)3次[6]。各農(nóng)藥回收率試驗結(jié)果如圖4所示。以MgSO4+PSA+GCB作為凈化劑時,吡蚜酮和辛硫磷的平均回收率分別只有37.7%和54.1%,而以MgSO4+PSA作凈化劑時,2種化合物的平均回收率分別為108.5%和92.3%。這可能是因為吡蚜酮和辛硫磷的分子結(jié)構(gòu)的平面化程度比較高(2種化合物均含有環(huán)狀平面結(jié)構(gòu)),凈化過程中對平面化合物具有吸附作用的平面層狀結(jié)構(gòu)的GCB吸附了這2種化合物[6]。綜合考慮8種農(nóng)藥的回收率,本文選擇使用MgSO4+PSA。

        圖4 不同凈化劑對農(nóng)藥回收率的影響Fig.4 The influence of different adsorbent on recoveries of pesticides

        2.4 基質(zhì)效應(yīng)

        基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect,ME)嚴(yán)重影響LC-MS/MS分析的準(zhǔn)確性。KMELLR等用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率的差異(%)來衡量基質(zhì)效應(yīng)的強弱,ME>20%表明有比較強的基質(zhì)增強效應(yīng),ME<-20%表明有比較強的基質(zhì)抑制效應(yīng)[14]。

        雖然本文通過凈化提取液、色譜分離和基質(zhì)稀釋等方法減弱了基質(zhì)效應(yīng),但如表2所示,樣品中的吡蚜酮和甲胺磷仍然表現(xiàn)出較強的基質(zhì)抑制效應(yīng)。反相色譜分離時最初流出的主要是基質(zhì)中的極性成分,可能這些成分大幅降低了吡蚜酮和甲胺磷在ESI源中的離子化效率,造成了較強的基質(zhì)抑制效應(yīng)[15-16]。本文利用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線來消除基質(zhì)效應(yīng)對定量分析的影響,以獲得更準(zhǔn)確的定量結(jié)果。

        2.5 回收率和精密度

        各農(nóng)藥的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如表2所示。在LOQ~50 ng/mL范圍內(nèi),8種農(nóng)藥的線性關(guān)系良好(R2均大于0.996)。

        表2 農(nóng)藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)(R2)、LOQs、線性范圍和METable 2 The linear equations, coefficients of determination (R2), LOQs, linear ranges and ME obtained for pesticides

        在1 LOQ和4 LOQ兩個濃度添加水平下進(jìn)行8種農(nóng)藥的回收率和精密度試驗,試驗重復(fù)6次[17]。回收率和精密度試驗結(jié)果如表3所示。在2個濃度添加水平下吡蚜酮的平均回收率分別為61%和63%,回收率偏低。這可能是因為速溶茶粉中的一些成分對吡蚜酮有吸附作用,造成乙腈萃取吡蚜酮的效率偏低。8種農(nóng)藥在2個濃度添加水平下的平均回收率均在61%~118%,RSD均在0.9%~10.5%,符合美國分析家化學(xué)協(xié)會(AOAC)對于農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留檢測分析的要求(回收率在50%~150%,RSD<15%)[6]。本方法的方法定量限小于或等于國標(biāo)和歐盟法令對茶葉及相關(guān)制品中這8種農(nóng)藥最大殘留限量的要求[18-21]。本方法可以滿足對速溶茶粉中這8種農(nóng)藥殘留檢測的要求。

        2.6 實際樣品的測定

        表3 農(nóng)藥的回收率和精密度Table 3 The recoveries and RSDs of pesticides spiked atlow and high concentrations

        應(yīng)用本方法檢測10個批次用低農(nóng)藥殘留茶葉生產(chǎn)的速溶茶粉和10個批次用普通茶葉生產(chǎn)的速溶茶粉。在10個批次的低農(nóng)速溶茶粉中均沒有檢出這8種農(nóng)藥殘留。在1個批次的普通速溶茶粉中檢出了0.032 mg/kg的甲胺磷殘留,雖然低于國標(biāo)和歐盟法令的要求(0.05 mg/kg和0.1 mg/kg),但速溶茶粉中檢出高毒的禁用農(nóng)藥仍應(yīng)引起足夠的重視。

        3 結(jié)論

        本文研究建立了QuEChERS前處理結(jié)合HPLC-MS/MS技術(shù)快速檢測速溶茶粉中8種農(nóng)藥殘留的方法,系統(tǒng)優(yōu)化了方法中的質(zhì)譜、色譜和前處理條件。良好的線性關(guān)系、回收率和精密度等指標(biāo)表明本方法可以對速溶茶粉中的這8種農(nóng)藥殘留進(jìn)行準(zhǔn)確的定量檢測。同時本方法靈敏度高、快速、消耗的有機溶劑少,以本方法為基礎(chǔ)可以進(jìn)一步開發(fā)速溶茶粉中其他多種農(nóng)藥殘留快速檢測的方法。

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