梁晶晶，沈丹，徐瀟穎，丁宇琦，羅金文*

1(浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江 杭州， 310052) 2(通標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，浙江 杭州， 310052)

青霉素族屬β-內(nèi)酰胺類抗生素，通過(guò)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁四肽側(cè)鏈和五肽交聯(lián)橋的結(jié)合來(lái)阻礙細(xì)胞壁合成，具有較強(qiáng)的殺菌作用，廣泛應(yīng)用于人和動(dòng)物尿道、胃腸道和呼吸道感染等疾病[1-2]。然而，部分養(yǎng)殖戶因其價(jià)格低廉、使用方便，在養(yǎng)殖過(guò)程中濫用青霉素類藥物，導(dǎo)致其在動(dòng)物組織中蓄積殘留。青霉素在動(dòng)物源性食品中的殘留會(huì)危害人體健康，破壞人類腸道的正常菌群環(huán)境，導(dǎo)致人體免疫力下降。為確保消費(fèi)者的安全，我國(guó)及歐盟等組織均對(duì)動(dòng)物組織中的青霉素類藥物殘留限量做了嚴(yán)格的規(guī)定。如我國(guó)規(guī)定所有動(dòng)物的肌肉、脂肪、肝、腎食品中阿莫西林和氨芐西林的最高殘留限量為50 μg/kg，氯唑西林和苯唑西林的最高殘留限量300 μg/kg[3]。青霉素藥物殘留依然是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。

目前，檢測(cè)青霉素類抗生素的方法主要有酶聯(lián)免疫法[4-5]、液相色譜法[6-8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[9-11]。酶聯(lián)免疫法屬于半定量篩查方法，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性現(xiàn)象；液相色譜法檢測(cè)抗生素, 定性效果差，且不適合多殘留同步分析。近年來(lái)，液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)技術(shù)由于兼具液相色譜的分離能力和串聯(lián)質(zhì)譜的高靈敏度、高專屬性特點(diǎn)，正逐漸成為獸藥殘留分析的有效手段，但現(xiàn)有的方法都存在前處理步驟繁瑣，測(cè)定周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)。

PRiME HLB是一種最新型的固相萃取柱，是基于“N-乙烯吡咯烷酮二乙烯基苯聚合物”填料的反相復(fù)合填料，該復(fù)合填料經(jīng)過(guò)特殊設(shè)計(jì)，對(duì)于動(dòng)物源性食品中的蛋白質(zhì)、脂肪和磷脂等物質(zhì)具有特異性的吸附能力，且無(wú)需活化與平衡，樣品經(jīng)有機(jī)溶劑提取后，可直接上樣到小柱上，操作極其簡(jiǎn)便，不會(huì)出現(xiàn)堵柱情況，最多只需3個(gè)步驟即可完成樣品制備過(guò)程，凈化速度可提高40%，凈化后，可以去除動(dòng)物源性食品中蛋白、脂肪和磷脂等95%以上的基質(zhì)干擾物，從而確保數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和可靠性。此方法只需采用最簡(jiǎn)單的過(guò)濾式樣品制備流程即可實(shí)現(xiàn)最潔凈的樣品凈化目標(biāo)，操作簡(jiǎn)單、省時(shí)快速。本研究采用PRiME HLB樣品凈化技術(shù)，超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)分析手段，測(cè)定食品中12種青霉素族抗生素類藥物殘留量的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器及材料

AB5500液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó) SCIEX)；甲醇，乙腈，甲酸(均為色譜純)；PRiME HLB固相萃取柱(Waters公司)；羥氨芐青霉素、氨芐青霉素、芐青霉素、苯氧甲基青霉素、苯唑青霉素、鄰氯青霉素、乙氧萘青霉素和雙氯青霉(Dr.Ehrenstorfer)；甲氧苯青霉素和哌拉西林(USP),苯咪青霉素(北京振翔)，氘代青霉素G(WITEGE)。

實(shí)驗(yàn)樣品：雞和鱸魚(yú)，取雞胸肉和鱸魚(yú)的肌肉部位進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

對(duì)照品儲(chǔ)備液配制：分別精密稱取適量的標(biāo)準(zhǔn)品(羥氨芐青霉素、氨芐青霉素、苯咪青霉素、甲氧苯青霉素、芐青霉素、苯氧甲基青霉素、苯唑青霉素、苯氧乙基青霉素、鄰氯青霉素、乙氧萘青霉素、雙氯青霉素、哌拉西林)，分別用30%乙腈水溶解并定容至25 mL，各青霉素類抗生素儲(chǔ)備液濃度為500 μg/mL，于-18 ℃下存放。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液的配制：分別精密移取適量對(duì)照品儲(chǔ)備液，用水配制成約500 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。

同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液：取適量的氘代青霉素G鹽，用30%乙腈水溶解并定容至25 mL，同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液濃度為200 μg/mL，于-18 ℃下保存。

同位素內(nèi)標(biāo)工作液：用純水將同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液稀釋500倍，配制成400 ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

1.2.2 樣品前處理

精密稱取2.5 g樣品(準(zhǔn)確至0.01 g)于50 mL離心管中，精密加入同位素內(nèi)標(biāo)工作液0.25 mL，加80%乙腈水溶液10 mL，渦旋混勻1 min，振蕩器振蕩30 min后，20 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至20 mL容量瓶中，殘?jiān)? mL 80%乙腈水溶液重復(fù)提取1次，合并上清液，用80%乙腈水溶液定容至20 mL，取5.0 mL加載到6CC規(guī)格的PRiME HLB 固相萃取柱，保持1 s 1滴的流速，取4 mL流出液于37 ℃下氮吹至小于0.7 mL，殘留液用純水定容至1.00 mL，過(guò)0.22 mL微孔濾膜，上LC-MS/MS測(cè)試。

1.2.3 空白基質(zhì)溶液的制備

取不含青霉素類藥物的空白樣品，除不加內(nèi)標(biāo)工作液外，同1.2.2處理，制得空白樣品基質(zhì)溶液。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密移取標(biāo)準(zhǔn)中間溶液和內(nèi)標(biāo)工作液適量(標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物濃度應(yīng)與樣品待測(cè)液中一致)，用空白樣品基質(zhì)溶液配制成5～100 ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.5 色譜與質(zhì)譜條件

液相采用CORTECS C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)；流動(dòng)相為A：0.1%甲酸水，B：甲醇；梯度洗脫程序(B變化)：0～3 min，15%～50%；3～6 min，50%～70%；6～8 min，保持70%，8～8.1 min，70%～15%，8.1～12 min，保持15%；流速：0.4 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

質(zhì)譜采用電噴霧離子源，正離子模式；電離電壓：5 500 v；離子源溫度：500 ℃；氣簾氣流速：30 L/min；碰撞氣流量：30 L/min。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS/MS parameters

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

CORTECS C18色譜柱采用不同鍵合相顆粒特性以及表面帶電修飾技術(shù)，具有柱效高、選擇性強(qiáng)，峰形好等優(yōu)點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)以CORTECS C18(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)作為分析柱，對(duì)比了甲醇和乙腈作為有機(jī)相時(shí)的分離效果，發(fā)現(xiàn)用甲醇作為有機(jī)相時(shí)各目標(biāo)化合物的分離效果更好，因此選擇甲醇作為有機(jī)相。ESI電離是在溶液狀態(tài)電離，而在水相中加入0.1%甲酸時(shí)，各化合物在ESI+模式下的離子化效果更好，峰形有所改善，靈敏度也相應(yīng)提高，因此本實(shí)驗(yàn)選取甲醇及0.1%甲酸水作為流動(dòng)相。經(jīng)甲醇-水梯度洗脫所得的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子流色譜圖Fig.1 Multiple reaction monitoring (MRM) chromatograms of mixed standards solution

2.2 提取溶劑和復(fù)溶溶液的選擇

因考慮到甲醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有羥基，會(huì)加速青霉素降解為青霉噻唑酸酯[12]，故選擇乙腈作為提取溶劑，預(yù)實(shí)驗(yàn)采用70%乙腈水和70%乙腈水(含0.1%甲酸)2種溶液作為提取劑，結(jié)果表明，用70%乙腈水(含0.1%甲酸)提取后，部分化合物回收率較低，不到60%，如阿莫西林、苯氧乙基青霉素，分析原因，由于多種青霉素類藥物在酸性條件下不穩(wěn)定所致。隨后考察了70%乙腈水、80%乙腈水和90%乙腈水3種不同配比的提取劑對(duì)提取率的影響，結(jié)果表明，80%乙腈水對(duì)于各個(gè)化合物的提取效率最好，都能達(dá)到80%以上，沉淀蛋白完全，易于離心分離。因此，提取溶劑采用80%乙腈水，不加酸。

復(fù)溶溶液的選擇：對(duì)比了30%乙腈水溶液、30%甲醇水溶液和純水作為復(fù)溶液的色譜圖，發(fā)現(xiàn)采用30%乙腈水和30%甲醇水溶液復(fù)溶后，阿莫西林產(chǎn)生較強(qiáng)的溶劑效應(yīng)，呈現(xiàn)雙峰，而用純水復(fù)溶后的阿莫西林峰形較好，因此，選擇純水作為復(fù)溶液。

2.3 氮?dú)鉂饪s條件的選擇

為了對(duì)凈化后的提取液進(jìn)行濃縮，提高檢測(cè)靈敏度，需對(duì)提取液進(jìn)行氮吹。由于青霉素類藥物具有光不穩(wěn)定性和熱不穩(wěn)定性的特點(diǎn)，在前處理操作中應(yīng)盡量避光、避熱，并且在較短的時(shí)間內(nèi)完成前處理過(guò)程，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，溫度過(guò)高都會(huì)影響穩(wěn)定性，加速其降解，因此，需對(duì)氮吹的溫度進(jìn)行研究與優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)考察了30、37和45 ℃ 3個(gè)氮吹溫度條件下各個(gè)化合物的穩(wěn)定性，結(jié)果表明，在30 ℃和45 ℃條件下，部分化合物有不同程度的降解，導(dǎo)致回收率在60%～80%，而在37 ℃條件下則可達(dá)到80%以上的回收率，認(rèn)為是由于30℃溫度雖低，但導(dǎo)致氮吹時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，以及45 ℃溫度過(guò)高加速降解所致。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇37 ℃作為氮吹的最佳溫度。

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

為了消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，本方法采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)青霉素類藥物進(jìn)行分析。按照優(yōu)化后的色譜條件對(duì)12種青霉素類藥物做基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，并按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢出限含量(見(jiàn)表2)做基質(zhì)加標(biāo)。結(jié)果表明12種青霉素在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2≥0.998，信噪比均大于3，說(shuō)明該方法檢出限能達(dá)到國(guó)標(biāo)方法規(guī)定的檢出限。

表2 12種青霉素族抗生素測(cè)定的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Linear equations, correlation coefficient and limit of detection of 12 penicillins antibiotics

續(xù)表2

化合物保留時(shí)間/min線性范圍/(μg·L-1)回歸方程相關(guān)系數(shù)檢出限/(μg·kg-1)苯氧乙基青霉素5.817.26～145.2y1=0.038 2x-0.018 9y2=0.041 1x-0.014 40.999 80.999 910.0鄰氯青霉素5.724.22～84.4y1=0.053 4x-0.035 7y2=0.056 9x-0.042 60.999 30.999 41.0乙氧萘青霉素6.153.91～78.2y1=0.26x-0.128y2=0.271x-0.1550.999 80.999 70.25雙氯青霉素6.094.88～97.6y1=0.017 6x-0.006 21y2=0.015 7x-0.005 990.999 70.999 92.0哌拉西林4.825.27～105.4y1=0.061 2x-0.013 6y2=0.059 8x-0.016 90.998 90.999 31.0

注：y1代表以雞肉為基質(zhì)的回歸方程，y2代表以魚(yú)肉為基質(zhì)的回歸方程。

分別對(duì)雞肉和魚(yú)肉(均為陰性樣品)進(jìn)行不同水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)濃度分別為20、50、150 μg/kg，每一濃度進(jìn)行6組平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，各組分的平均回收率在81.7%～111.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.89%～8.56%，說(shuō)明該方法具有良好的準(zhǔn)確性和精密度。

表3 12種青霉素族抗生素測(cè)定的回收率和精密度Table 3 recovery and precision of 12 penicillins antibiotics

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

從市場(chǎng)上抽取雞肉、豬肉和魚(yú)各10份，利用本方法對(duì)其進(jìn)行青霉素類藥物殘留檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果均為陰性。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用PRiME HLB凈化技術(shù)，采用超高效液相色譜-四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用方法建立了動(dòng)物源性食品中青霉素族抗生素類藥物殘留的檢測(cè)方法，各組分在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2≥0.998，平均回收率在81.7%～111.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.89%～8.56%，方法檢出限達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢出限含量。因此，本方法用于動(dòng)物源性食品中青霉素族抗生素藥物殘留檢測(cè)，具有準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

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