張國(guó)斌

（沈陽(yáng)市疾病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽(yáng) 110031）

本實(shí)驗(yàn)對(duì)液相芯片技術(shù)在檢測(cè)耐藥結(jié)核分歧桿菌方式的可行性加以研究，利用對(duì)內(nèi)含rpoB526和rpoB531以及katG315的耐藥突變性基因位點(diǎn)，對(duì)直立濃度稀釋情況進(jìn)行模擬，分析此法在檢測(cè)多藥結(jié)核分歧桿菌最低濃度，結(jié)合最佳反應(yīng)體系，監(jiān)測(cè)重組質(zhì)粒，分析相關(guān)方式的穩(wěn)定性和特異性。

1 資料與方法

1.1 儀器與材料：選擇含有atG315、rpoB526和rpoB531的耐藥突變基因位點(diǎn)模擬性質(zhì)粒為實(shí)驗(yàn)材料。實(shí)驗(yàn)設(shè)備為懸浮芯片系統(tǒng)（200液相），離心機(jī)，96孔板離心機(jī)，梯度PCR設(shè)備，核酸電泳設(shè)備，凝膠成像體系，微孔恒溫震蕩設(shè)備，壓力式蒸汽滅菌設(shè)備，恒溫?fù)u床，pH計(jì)，渦旋震蕩設(shè)備。移液器。

設(shè)備類型為：熒光微球，DNA聚合酶，鞘液，dATP，Biotin-14-dCTP，dGTP，ExoSAP-IT PCR引物以及ASPE引物。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)配制：氨芐青霉素、LB液培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、50*TEA緩沖液、2*雜交緩沖液、1*雜交緩沖液。

1.2 方法

1.2.1 靈敏度實(shí)驗(yàn)：對(duì)于移液器、無(wú)菌操作臺(tái)和槍頭實(shí)施紫外線滅菌，照射時(shí)間為20 min，后在實(shí)驗(yàn)前使用濃度為75%的乙醇擦拭操作臺(tái)和雙手。

使用移液器，在吸取劑量為5 μL內(nèi)含katG315、rpoB526和rpoB531突變基因位點(diǎn)的菌種，將其加入到5 mL含有Amp抗性LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，在37 ℃環(huán)境下，220 rpm搖床內(nèi)過(guò)夜培養(yǎng)。完成質(zhì)粒提取后，將重組質(zhì)粒濃度稀釋到150 ng/μL，后稀釋濃度，設(shè)定陰性對(duì)照。稀釋后質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增和純化，在此同時(shí)完成熒光微球雜交、ASPE檢測(cè)樣本，上述質(zhì)粒每個(gè)濃度取3個(gè)平行樣本。將獲取后樣本利用設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)，獲得最低濃度。

1.2.2 重復(fù)實(shí)驗(yàn)：結(jié)合8個(gè)濃度相同的重組質(zhì)粒，結(jié)合最佳反應(yīng)條件，相隔2 d實(shí)施PCR擴(kuò)增和純化、熒光微球以及ASPE反應(yīng)1次。將獲取的樣本使用平行儀器加以檢測(cè)，共計(jì)5次。每次檢驗(yàn)時(shí)，擇取3個(gè)平行樣本，后結(jié)合樣本，計(jì)算出MFI值，視為每次檢測(cè)的最終結(jié)果，后將每個(gè)質(zhì)粒的多次檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，算出SD值以及變異系數(shù)（CV）。

2 結(jié) 果

2.1 靈敏度檢查：結(jié)合每種質(zhì)粒平行樣本檢測(cè)結(jié)果，算出MFI值和SD值，所檢測(cè)出的熒光信號(hào)隨著質(zhì)粒濃度的變化而變化。表1顯示出8類重組質(zhì)粒檢測(cè)的最低濃度，結(jié)果提示，此法能夠檢測(cè)出最低的質(zhì)粒濃度為1 ng/mL，靈敏度較高。

表1 8類質(zhì)粒最低間檢出濃度情況

2.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：在最佳反應(yīng)條件下，相隔2 d對(duì)8種質(zhì)粒實(shí)施檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)5次檢測(cè)可判斷出katG315、rpoB526以及rpoB531位點(diǎn)基因型，結(jié)合相關(guān)結(jié)果，計(jì)算SD值和熒光值。陰性對(duì)照的MFI為（37±9.95），質(zhì)粒樣本變異系數(shù)為6.73%～13.75%，證實(shí)此法穩(wěn)定性強(qiáng)。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)分析了液相芯片技術(shù)檢測(cè)耐多藥結(jié)核分枝桿菌方法靈敏性、重復(fù)性和特異性加以驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)，此法能夠檢測(cè)出最低的質(zhì)粒濃度為1 ng/mL，靈敏度較高。5次檢測(cè)可判斷出katG315、rpoB526以及rpoB531位點(diǎn)基因型，結(jié)合相關(guān)結(jié)果，計(jì)算SD值和熒光值。陰性對(duì)照的MFI為（37±9.95），質(zhì)粒樣本變異系數(shù)為6.73%-13.75%，證實(shí)此法穩(wěn)定性強(qiáng)。

值得說(shuō)明的是，有文獻(xiàn)指出[1]，液相芯片技術(shù)檢測(cè)耐多藥結(jié)核分枝桿菌方法可以精確的檢測(cè)出質(zhì)粒內(nèi)單位點(diǎn)以及多位點(diǎn)，且檢測(cè)點(diǎn)之間無(wú)信號(hào)干擾[2]，每個(gè)ASPE引物只能在該檢測(cè)點(diǎn)基因型加以檢測(cè)，特異性高，另外，該項(xiàng)技術(shù)中的熒光微球種類多達(dá)100余個(gè)，這在一定程度上確保了高通量檢測(cè)。在實(shí)施檢查過(guò)程中，僅需要結(jié)合檢測(cè)序列信息所使用熒光微球中的相關(guān)信息，就能夠設(shè)計(jì)出不同的ASPE引物。就能夠完成耐藥結(jié)核分歧桿菌多位點(diǎn)檢測(cè)[3]。

值得說(shuō)明的是，這項(xiàng)技術(shù)在操作上相當(dāng)簡(jiǎn)便，1位實(shí)驗(yàn)者在8 h內(nèi)就能夠完成上百個(gè)突變位點(diǎn)檢查，在一定程度上節(jié)省了檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)。既往藥敏測(cè)試法、序列測(cè)試法等檢測(cè)周期較高，工作量大，無(wú)法在同一個(gè)時(shí)間內(nèi)完成多樣品操作。與之相較而言，液相芯片法在一定程度上節(jié)省了人力和時(shí)間，可在較短操作周期內(nèi)完成多樣本操作[4]，節(jié)省人力和工作時(shí)長(zhǎng)，短時(shí)間內(nèi)取得檢測(cè)結(jié)果，方便醫(yī)師制定治療方案，令患者可及時(shí)接受治療。除了可令病患及時(shí)得到治療，延緩疾病惡化外，還能夠減少耐多藥結(jié)核病傳播和發(fā)展，進(jìn)而控制病情，減少患者發(fā)生耐多藥結(jié)核風(fēng)險(xiǎn)。

就檢測(cè)成本角度來(lái)看，利用液相芯片技術(shù)對(duì)耐多藥結(jié)核桿菌進(jìn)行分離時(shí)，每個(gè)檢測(cè)樣本的成本僅為80元，如果需要額外增加新的位點(diǎn)，僅僅需要增加與之對(duì)應(yīng)的引物以及熒光微球，后者成本為3元人民幣。雖說(shuō)Xpert試劑盒可在短時(shí)間內(nèi)取得檢測(cè)結(jié)果，但其成本較高[5]。既往金標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序法需要大量克隆檢測(cè)片，只有這樣，才能夠確保檢驗(yàn)結(jié)果的精準(zhǔn)性，檢測(cè)單個(gè)樣本的成本大約為620元人民幣。

由此能夠看出，使用液相芯片技術(shù)檢測(cè)多藥結(jié)核分歧桿菌價(jià)格低廉，適合發(fā)展中國(guó)家開(kāi)展，由此可見(jiàn)，此法在檢耐多藥結(jié)核分歧桿菌上，具有更高的應(yīng)用價(jià)值。

4 小 結(jié)

本次實(shí)驗(yàn)全面結(jié)合了液相芯片技術(shù)和等位基因引物延伸反應(yīng)，創(chuàng)建了檢測(cè)耐多藥結(jié)核分歧桿菌的新方式。翻閱近幾年文獻(xiàn)可知。結(jié)核分歧桿菌耐藥和基因突變存在相關(guān)性，katG315、rpoB526和rpoB531基因位點(diǎn)為常見(jiàn)突變點(diǎn)，在此其中katG315會(huì)引起結(jié)核桿菌對(duì)異煙肼耐藥，而其他兩種基因點(diǎn)會(huì)對(duì)利福平耐藥。基于此，本實(shí)驗(yàn)利用液相芯片技術(shù)對(duì)以上耐藥基因位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。

經(jīng)證實(shí)，該項(xiàng)技術(shù)在檢測(cè)結(jié)核分支桿菌的靈敏性、重復(fù)性較好，可靠性高，能夠精準(zhǔn)的檢測(cè)出各個(gè)基因位點(diǎn)突變情況，值得說(shuō)明的是，液相芯片技術(shù)經(jīng)濟(jì)性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單，快速，值得進(jìn)一步在臨床中推廣使用。

[1] 芮冬妹,朱珍,樊燕,等.基因芯片技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼耐藥性的結(jié)果分析及臨床價(jià)值[J].廣西醫(yī)學(xué),2017,39(1):98-99.

[2] 吳國(guó)蘭,陳曉紅,翁麗珍,等.基因芯片技術(shù)在鑒定分枝桿菌屬及早期診斷耐藥結(jié)核中的價(jià)值分析[J].中國(guó)醫(yī)刊,2016,51(5):44-47.

[3] 趙永,梁慶福,林淑芳,等.Xpert MTB/RIF檢測(cè)技術(shù)用于耐多藥結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥檢測(cè)分析[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2015(15):2621-2622.

[4] 楊慧娟,馬利,陳連勇,等.Xpert MTB/RIF技術(shù)對(duì)結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)和耐多藥結(jié)核快速篩查的研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2015(23):4056-4059.

[5] 舒麗紅,丁顯平.基因芯片方法檢測(cè)耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌準(zhǔn)確性的Meta分析[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2016,13(15):2121-2125.