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        基于免疫共沉淀-液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的新型孕烷X受體配體檢測(cè)方法的建立

        2018-06-13 03:34:22趙爽姜棋予孫慧偉柴燕濤李曉娟王志杰侯俊趙敏
        生物技術(shù)通訊 2018年3期
        關(guān)鍵詞:螢光報(bào)告基因利福平

        趙爽,姜棋予,孫慧偉,柴燕濤,李曉娟,王志杰,侯俊,趙敏

        1.北京大學(xué)三〇二臨床醫(yī)學(xué)院;2.解放軍第三〇二醫(yī)院 臨床研究管理中心;北京 100039

        肝炎病毒在我國(guó)有很高的感染率,超過(guò)8000萬(wàn)人攜帶肝炎病毒或罹患肝炎病毒引起的各種慢性肝病,盡管對(duì)癥治療(如各種抗病毒治療策略)能夠發(fā)揮抗病毒作用、延緩疾病惡化,但仍有相當(dāng)比例的患者最終會(huì)進(jìn)展為肝細(xì)胞癌(hepato?cellularcarcinoma,HCC),對(duì)我國(guó)的公共衛(wèi)生系統(tǒng)以及臨床診療構(gòu)成巨大挑戰(zhàn)[1]。在此基礎(chǔ)上,受限于現(xiàn)有臨床診療技術(shù),大部分HCC患者初診即為進(jìn)展期(advancedHCC),失去手術(shù)治療等根治性治療的機(jī)會(huì),因此抗腫瘤藥物治療具有極其重要的地位[1]。進(jìn)展期肝細(xì)胞癌治療藥物極為有限,主要是多靶標(biāo)蛋白激酶抑制劑等分子靶向藥物,包括惟一的一線治療藥物索拉非尼(sorafenib),以及少數(shù)二線治療藥物如瑞戈非尼(regorafenib)或阿帕替尼(apatinib)等[2-4]。盡管索拉非尼的廣泛使用能夠在一定程度上延長(zhǎng)患者生存期、改善患者生存質(zhì)量,但僅有部分患者(26%~43%)對(duì)索拉非尼敏感,而隨著治療的進(jìn)行,這些對(duì)索拉非尼初始敏感的患者,往往會(huì)出現(xiàn)對(duì)藥物的耐受[5]。因此,探究進(jìn)展期HCC患者接受分子靶向治療敏感性差異和耐藥相關(guān)調(diào)控機(jī)制具有重要意義。

        目前,對(duì)進(jìn)展期HCC分子靶向治療耐藥的機(jī)制相關(guān)研究主要是探索不同信號(hào)通路之間的相互作用,如MAPK、PI3K/AKT等[5]。HCC除分子靶向治療耐藥外,還具有對(duì)傳統(tǒng)細(xì)胞毒性化療藥物的多藥耐藥(multi-drug resistance,MDR)[6]。盡管取得了一些進(jìn)展,但現(xiàn)有研究理論或模型等涉及的信號(hào)通路并非HCC特異的,也難以揭示HCC抗腫瘤耐藥的根源。我們的前期研究表明,孕烷X受體(pregnane X receptor,PXR)是一種重要的核受體,多種內(nèi)/外源小分子藥物/毒物都能夠作為PXR的配體/激動(dòng)劑識(shí)別和活化PXR,誘導(dǎo)PXR下游基因的表達(dá)[7]。PXR的下游基因種類多樣、作用廣泛,包括各類耐藥蛋白(即藥物Ⅲ相代謝酶/藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體)、細(xì)胞色素氧化酶CYP450(即藥物Ⅰ相代謝酶/藥物氧化代謝酶)、基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶(即藥物Ⅱ相代謝酶/基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶)。這些既是人體外源性毒物代謝、清除與解毒所必需的,也是各種藥物耐藥相關(guān)蛋白。PXR作為肝臟對(duì)外源性藥物和毒物代謝與解毒機(jī)制的調(diào)控樞紐,活化的PXR最終通過(guò)這些代謝相關(guān)蛋白加速抗腫瘤藥物的代謝與清除等過(guò)程,最終影響HCC的治療效果[8]。由于肝臟是人體代謝中心,而HCC細(xì)胞具有更為旺盛的物質(zhì)攝取和代謝特性,因此PXR介導(dǎo)的抗腫瘤藥物的代謝與清除機(jī)制可能是HCC對(duì)抗腫瘤藥物MDR的根本來(lái)源和特異性機(jī)制。

        綜上所述,作為配體依賴的轉(zhuǎn)錄因子(核受體),PXR的活性與其配體/激動(dòng)劑等密切相關(guān)??鼓[瘤藥物、農(nóng)藥、環(huán)境污染物及各類固醇類激素等小分子物質(zhì),都有可能作為PXR的配體參與調(diào)控抗腫瘤藥物耐藥,研究與確證這些小分子與PXR的相互作用具有重要意義[8]。但目前的研究技術(shù)存在諸多限制:螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、細(xì)胞免疫熒光與核質(zhì)分離、染色質(zhì)免疫共沉淀等技術(shù)僅可在細(xì)胞體系中觀測(cè)小分子化合物對(duì)核受體等生物大分子的影響[9];表面等離子共振(sur?facep lasmon resonance,SPR)等技術(shù)對(duì)設(shè)備要求較高,也難以直接觀測(cè)生物大分子與小分子的相互作用[10];對(duì)蛋白質(zhì)等生物大分子可使用抗原-抗體相互識(shí)別進(jìn)行檢測(cè),而傳統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究技術(shù)、策略難以檢測(cè)與識(shí)別小分子化合物。為解決這一問(wèn)題,我們選取已知的PXR激動(dòng)劑利福平為模型藥物,采用免疫共沉淀技術(shù),形成生物大分子PXR與小分子利福平的復(fù)合物,利用免疫印跡實(shí)驗(yàn)識(shí)別復(fù)合物中的蛋白分子,用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS/MS)識(shí)別復(fù)合物中的小分子,最終建立了基于免疫共沉淀-液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的新型PXR配體檢測(cè)方法。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        HEK293細(xì)胞,肝細(xì)胞癌細(xì)胞HepG2,前列腺癌細(xì)胞系LNCaP、PC-3由本實(shí)驗(yàn)室保存;帶有Flag標(biāo)簽的雄激素受體(androgen receptor,AR),PXR表達(dá)載體,PXR下游基因CYP3A4啟動(dòng)子區(qū)序列(XREM與PXRE區(qū)域)的螢光素酶報(bào)告基因載體XREM-Luc、PXRE-Luc,AR應(yīng)答元件(andro?gen response element,ARE)報(bào)告基因載體(ARELuc)等由本實(shí)驗(yàn)室保存[11-13];利福平(Rifampicin)購(gòu)自Selleck公司;雄激素二氫睪酮(dihydrotestos?terone,DHT)購(gòu)自Sigma公司;常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)試劑[DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)等]購(gòu)自Hyclone公司;細(xì)胞培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板等實(shí)驗(yàn)耗材購(gòu)自Corning公司;1.5mLEP管購(gòu)自Eppendorf公司;真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipo?fectAMINE 2000為Invitrogen公司產(chǎn)品;Flagbeads、Flag抗體、乙腈(acetonitrile,ACN)及二甲亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)等為 Sigma公司產(chǎn)品;蛋白印跡實(shí)驗(yàn)使用的化學(xué)發(fā)光試劑盒為北京天根公司產(chǎn)品;常規(guī)儀器均由本實(shí)驗(yàn)室提供;液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用設(shè)備由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供。

        1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

        HEK293細(xì)胞于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)于添加10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液中;HepG2細(xì)胞于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)于添加10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中。在真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染過(guò)程中,細(xì)胞培養(yǎng)至指數(shù)增長(zhǎng)期,待其狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),取0.5μLLipofectAMINE2000試劑與Flag-AR、Flag-PXR表達(dá)載體(用5μL無(wú)血清無(wú)抗生素的DMEM培養(yǎng)液充分溶解與稀釋)分別加入2個(gè)EP管中,每管添加24.5或20μL無(wú)血清無(wú)抗生素的DMEM培養(yǎng)基,充分混勻后室溫靜置15min,最后將2管液體等量混合,輕輕混勻后室溫靜置15 min即為轉(zhuǎn)染工作液。細(xì)胞換為無(wú)血清培養(yǎng)基,將配制所得轉(zhuǎn)染工作液輕輕、緩慢加入細(xì)胞中,37℃孵育4h后換液,用含10%FBS的培養(yǎng)液持續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。

        1.3 藥物配制

        用精密天平稱取藥物,用DMSO充分溶解藥物。對(duì)于小分子、蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn),藥物用DMSO溶解后,用生理鹽水稀釋,終濃度為1μmol/L;對(duì)于螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),用DMSO溶解利福平后,配制為10、3、1、0.3、0.1、0.03及 0.01mmol/L等系列濃度梯度的工作液,在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋,最終藥物作用于細(xì)胞的濃度為 10、3、1、0.3、0.1、0.03及0.01μmol/L,DMSO濃度約為1‰。

        1.4 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用實(shí)驗(yàn)

        用乙腈配制利福平溶液,按照Dompreh等[14]的方法進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè),表1列出具體的實(shí)驗(yàn)/檢測(cè)條件。利福平相對(duì)分子質(zhì)量為823(母離子),在施加電壓后利福平離子被打碎,釋放出一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量約791的分子碎片(為子離子),以在這一過(guò)程中的利福平相對(duì)分子質(zhì)量變化(823/791)為其檢測(cè)特征。

        1.5 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)

        在約2×108HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Flag空載體、Flag-AR或Flag-PXR的表達(dá)載體48h后收集細(xì)胞并裂解,用高鹽的免疫共沉淀緩沖液進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),用Flag-beads將Flag、Flag-AR或Flag-PXR蛋白從體系中分離出來(lái)。在此基礎(chǔ)上,將Flag-beads-蛋白復(fù)合物與1μmol/L利福平溶液于4℃孵育過(guò)夜。通過(guò)免疫印跡方法檢測(cè)Flagbeads-蛋白-利福平復(fù)合物中的Flag-AR與Flag-PXR,用液相色譜檢測(cè)復(fù)合物中的利福平。按照Ding等[15]的方法進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn),辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的Flag單克隆抗體稀釋為1∶5000。

        1.6 螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

        PXR轉(zhuǎn)錄因子活性檢測(cè):在HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Flag-PXR表達(dá)載體以及螢光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體XREM-Luc(含PXR下游基因CYP3A4增強(qiáng)子區(qū)域-7836/-7208序列)、PXRE-Luc(含PXR下游基因CYP3A4啟動(dòng)子區(qū)域-362/+52序列);在HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Flag-PXR表達(dá)載體以及螢光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體XREM-Luc。

        表1 液相色譜-質(zhì)譜參數(shù)

        AR轉(zhuǎn)錄因子活性檢測(cè):在PC-3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Flag-AR表達(dá)載體及螢光素酶報(bào)告基因ARE-Luc表達(dá)載體,在LNCaP細(xì)胞中轉(zhuǎn)染螢光素酶報(bào)告基因ARE-Luc表達(dá)載體。

        轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)24h后收集細(xì)胞并裂解,依據(jù)Yang等的方法檢測(cè)報(bào)告基因的螢光素酶活性[16]。

        1.7 統(tǒng)計(jì)分析

        應(yīng)用SPSS17.0軟件,采用單因素方差分析比較x±s,計(jì)算P值。

        2 結(jié)果

        2.1 用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)利福平

        結(jié)果如圖1,檢測(cè)到利福平的母離子/子離子對(duì)(Pair),表明建立了利福平的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)方法。

        2.2 Flag-PXR與Flag-AR的免疫共沉淀檢測(cè)

        結(jié)果如圖2,轉(zhuǎn)染Flag-PXR與Flag-AR的表達(dá)載體,能夠在HEK293細(xì)胞中表達(dá)相應(yīng)融合蛋白;Flag-beads能夠從HEK293細(xì)胞體系中分離得到Flag-PXR與Flag-AR蛋白。這表明可以利用Flag-beads從HEK293細(xì)胞中免疫共沉淀Flag融合蛋白,并用免疫印跡實(shí)驗(yàn)對(duì)Flag-beads-Flag蛋白復(fù)合物中的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。

        2.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)蛋白-小分子復(fù)合物中的利福平

        用乙腈將復(fù)合物中的利福平萃取出來(lái),采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè),在特異性確證(利用特異性相對(duì)分子質(zhì)量的823/791離子對(duì)確證檢測(cè)到利福平)后,用質(zhì)譜掃描與記錄檢測(cè)到的823離子信號(hào)(圖3);在此基礎(chǔ)上,能夠從利福平溶液(In?put)中檢測(cè)到利福平的液-質(zhì)信號(hào),從空載體(Flag)組、Flag-AR組微珠中無(wú)法檢測(cè)到利福平,而從Flag-PXR組微珠中能夠檢測(cè)到明確的利福平信號(hào)(圖4)。這表明,只有PXR而非Flag標(biāo)簽或Flag-AR能夠與利福平相互作用。

        我們不得不承認(rèn),現(xiàn)代詩(shī)的進(jìn)一步成就的學(xué)習(xí)不能僅僅依靠課堂上的幾十分鐘,現(xiàn)代詩(shī)的美和它的寫(xiě)作藝術(shù)都是值得我們學(xué)習(xí)和考究的。戴望舒在《雨巷》的創(chuàng)作中,不僅將中國(guó)詩(shī)歌的典雅清韻運(yùn)用得淋漓盡致,而且還將國(guó)外現(xiàn)代詩(shī)的精華與之結(jié)合,這無(wú)疑將現(xiàn)代詩(shī)向前推進(jìn)了一大步。他的大膽和勇敢造就了他,也成就了《雨巷》,成為現(xiàn)代詩(shī)的絕唱,使得無(wú)數(shù)讀者被它的美所感染。

        2.4 利福平誘導(dǎo)PXR轉(zhuǎn)錄因子活性的螢光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)

        前述可知,PXR能夠與利福平相互作用。為確定利福平作用于PXR的特異性,利用螢光素酶報(bào)告基因活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)利福平對(duì)PXR轉(zhuǎn)錄因子活性的影響,結(jié)果如圖5,利福平能夠劑量依賴地誘導(dǎo)PXR的轉(zhuǎn)錄因子活性。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步檢測(cè)了利福平對(duì)AR轉(zhuǎn)錄因子活性的影響,結(jié)果如圖6,利福平不能誘導(dǎo)AR的轉(zhuǎn)錄因子活性。轉(zhuǎn)錄因子活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了小分子與核受體的相互作用。

        3 討論

        進(jìn)展期肝細(xì)胞癌藥物研發(fā)與臨床診療面臨巨大挑戰(zhàn),闡明抗腫瘤藥物耐藥的機(jī)制,研究與開(kāi)發(fā)逆轉(zhuǎn)耐藥的干預(yù)策略具有重要意義。我們的前期研究著眼于肝細(xì)胞癌自身的特性:肝臟是人體代謝的中心,而HCC細(xì)胞具有更為旺盛的物質(zhì)攝取和代謝特性,因此PXR介導(dǎo)的抗腫瘤藥物的代謝與清除機(jī)制可能是HCC對(duì)抗腫瘤藥物MDR的根本來(lái)源和特異性機(jī)制,最終發(fā)現(xiàn)與提出PXR的活化進(jìn)而誘導(dǎo)抗腫瘤藥物代謝與清除,最終造成抗腫瘤藥物耐藥[3,17]。PXR的配體或激動(dòng)劑是PXR活化所必需的,因此檢測(cè)與確證小分子化合物是否能夠與PXR結(jié)合并相互作用具有重要意義[7-8]。

        圖1 基于母離子/子離子對(duì)的利福平液相質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)方法

        盡管發(fā)現(xiàn)與鑒定PXR的潛在配體或激動(dòng)劑具有重要意義,但這一研究也對(duì)現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)技術(shù)構(gòu)成巨大挑戰(zhàn)。對(duì)于傳統(tǒng)生化或細(xì)胞學(xué)研究者,可通過(guò)抗原-抗體識(shí)別等技術(shù)研究蛋白質(zhì)等生物大分子,通過(guò)PCR等特異性擴(kuò)增目的核酸片段,但小分子化合物的研究與鑒定是難點(diǎn)。以螢光素酶報(bào)告基因等為代表的生化與細(xì)胞學(xué)研究技術(shù)僅能間接反映小分子對(duì)生物大分子的影響。最近被廣泛應(yīng)用的SRP等技術(shù)雖然能夠檢測(cè)蛋白質(zhì)與小分子的相互作用,但設(shè)備要求很高且實(shí)驗(yàn)費(fèi)用昂貴,仍然是間接檢測(cè):蛋白質(zhì)與小分子結(jié)合后,其構(gòu)象等性質(zhì)發(fā)生變化,通過(guò)生物-化學(xué)/生物-物理傳感器等檢測(cè)到蛋白性質(zhì)的變化,間接反應(yīng)出蛋白與小分子的結(jié)合或相互作用。

        圖2 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)與識(shí)別Flag融合蛋白

        為進(jìn)一步完善相關(guān)研究,本研究建立了基于免疫共沉淀-液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的PXR配體檢測(cè)方法:用免疫共沉淀與免疫印跡技術(shù)識(shí)別蛋白-小分子復(fù)合物中的蛋白質(zhì)組分,用LC-MS/MS技術(shù)識(shí)別蛋白-小分子復(fù)合物中的小分子化合物。在HEK3293細(xì)胞中表達(dá)得到帶有Flag標(biāo)簽的目的蛋白Flag-PXR與Flag-AR,用Flag-beads將這些蛋白分離純化,再與利福平溶液孵育。用Flag抗體可對(duì)Flag-PXR、Flag-AR蛋白進(jìn)行檢測(cè),用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)復(fù)合物中的利福平進(jìn)行識(shí)別。

        圖3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)利福平

        圖4 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)復(fù)合物中的利福平

        圖5 利福平對(duì)PXR轉(zhuǎn)錄因子活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

        圖6 利福平對(duì)AR轉(zhuǎn)錄因子活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

        作為低背景的細(xì)胞模型,HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率很高,是研究的理想模型,結(jié)果特異性較高。免疫共沉淀相關(guān)技術(shù)是特異性檢測(cè)蛋白質(zhì)的常用技術(shù),同時(shí)免疫共沉淀系統(tǒng)對(duì)樣品有純化與富集作用,也更利于LC-MS/MS檢測(cè)。在此基礎(chǔ)上,聯(lián)合使用螢光素酶共沉淀實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驅(qū)π》肿幼饔玫奶禺愋赃M(jìn)行驗(yàn)證。值得一提的是,雄激素受體被用作無(wú)關(guān)對(duì)照,目前尚無(wú)利福平影響AR的報(bào)道,本研究中利福平不能與AR相互作用,也不能誘導(dǎo)AR的轉(zhuǎn)錄因子活性。綜上所述,我們建立了基于免疫共沉淀-液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的新型孕烷X受體配體檢測(cè)方法,能夠利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)-小分子復(fù)合物中的小分子化合物進(jìn)行直接觀測(cè),這不僅拓展了我們對(duì)大分子-小分子相互作用的研究,也對(duì)抗腫瘤藥物耐藥研究具有重要意義。

        參考文獻(xiàn)

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