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        基于免疫共沉淀-液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的新型孕烷X受體配體檢測方法的建立

        2018-06-13 03:34:22趙爽姜棋予孫慧偉柴燕濤李曉娟王志杰侯俊趙敏
        生物技術(shù)通訊 2018年3期
        關(guān)鍵詞:螢光報告基因利福平

        趙爽,姜棋予,孫慧偉,柴燕濤,李曉娟,王志杰,侯俊,趙敏

        1.北京大學三〇二臨床醫(yī)學院;2.解放軍第三〇二醫(yī)院 臨床研究管理中心;北京 100039

        肝炎病毒在我國有很高的感染率,超過8000萬人攜帶肝炎病毒或罹患肝炎病毒引起的各種慢性肝病,盡管對癥治療(如各種抗病毒治療策略)能夠發(fā)揮抗病毒作用、延緩疾病惡化,但仍有相當比例的患者最終會進展為肝細胞癌(hepato?cellularcarcinoma,HCC),對我國的公共衛(wèi)生系統(tǒng)以及臨床診療構(gòu)成巨大挑戰(zhàn)[1]。在此基礎(chǔ)上,受限于現(xiàn)有臨床診療技術(shù),大部分HCC患者初診即為進展期(advancedHCC),失去手術(shù)治療等根治性治療的機會,因此抗腫瘤藥物治療具有極其重要的地位[1]。進展期肝細胞癌治療藥物極為有限,主要是多靶標蛋白激酶抑制劑等分子靶向藥物,包括惟一的一線治療藥物索拉非尼(sorafenib),以及少數(shù)二線治療藥物如瑞戈非尼(regorafenib)或阿帕替尼(apatinib)等[2-4]。盡管索拉非尼的廣泛使用能夠在一定程度上延長患者生存期、改善患者生存質(zhì)量,但僅有部分患者(26%~43%)對索拉非尼敏感,而隨著治療的進行,這些對索拉非尼初始敏感的患者,往往會出現(xiàn)對藥物的耐受[5]。因此,探究進展期HCC患者接受分子靶向治療敏感性差異和耐藥相關(guān)調(diào)控機制具有重要意義。

        目前,對進展期HCC分子靶向治療耐藥的機制相關(guān)研究主要是探索不同信號通路之間的相互作用,如MAPK、PI3K/AKT等[5]。HCC除分子靶向治療耐藥外,還具有對傳統(tǒng)細胞毒性化療藥物的多藥耐藥(multi-drug resistance,MDR)[6]。盡管取得了一些進展,但現(xiàn)有研究理論或模型等涉及的信號通路并非HCC特異的,也難以揭示HCC抗腫瘤耐藥的根源。我們的前期研究表明,孕烷X受體(pregnane X receptor,PXR)是一種重要的核受體,多種內(nèi)/外源小分子藥物/毒物都能夠作為PXR的配體/激動劑識別和活化PXR,誘導PXR下游基因的表達[7]。PXR的下游基因種類多樣、作用廣泛,包括各類耐藥蛋白(即藥物Ⅲ相代謝酶/藥物轉(zhuǎn)運體)、細胞色素氧化酶CYP450(即藥物Ⅰ相代謝酶/藥物氧化代謝酶)、基團轉(zhuǎn)移酶(即藥物Ⅱ相代謝酶/基團轉(zhuǎn)移酶)。這些既是人體外源性毒物代謝、清除與解毒所必需的,也是各種藥物耐藥相關(guān)蛋白。PXR作為肝臟對外源性藥物和毒物代謝與解毒機制的調(diào)控樞紐,活化的PXR最終通過這些代謝相關(guān)蛋白加速抗腫瘤藥物的代謝與清除等過程,最終影響HCC的治療效果[8]。由于肝臟是人體代謝中心,而HCC細胞具有更為旺盛的物質(zhì)攝取和代謝特性,因此PXR介導的抗腫瘤藥物的代謝與清除機制可能是HCC對抗腫瘤藥物MDR的根本來源和特異性機制。

        綜上所述,作為配體依賴的轉(zhuǎn)錄因子(核受體),PXR的活性與其配體/激動劑等密切相關(guān)。抗腫瘤藥物、農(nóng)藥、環(huán)境污染物及各類固醇類激素等小分子物質(zhì),都有可能作為PXR的配體參與調(diào)控抗腫瘤藥物耐藥,研究與確證這些小分子與PXR的相互作用具有重要意義[8]。但目前的研究技術(shù)存在諸多限制:螢光素酶報告基因?qū)嶒?、細胞免疫熒光與核質(zhì)分離、染色質(zhì)免疫共沉淀等技術(shù)僅可在細胞體系中觀測小分子化合物對核受體等生物大分子的影響[9];表面等離子共振(sur?facep lasmon resonance,SPR)等技術(shù)對設(shè)備要求較高,也難以直接觀測生物大分子與小分子的相互作用[10];對蛋白質(zhì)等生物大分子可使用抗原-抗體相互識別進行檢測,而傳統(tǒng)生物醫(yī)學研究技術(shù)、策略難以檢測與識別小分子化合物。為解決這一問題,我們選取已知的PXR激動劑利福平為模型藥物,采用免疫共沉淀技術(shù),形成生物大分子PXR與小分子利福平的復合物,利用免疫印跡實驗識別復合物中的蛋白分子,用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS/MS)識別復合物中的小分子,最終建立了基于免疫共沉淀-液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的新型PXR配體檢測方法。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        HEK293細胞,肝細胞癌細胞HepG2,前列腺癌細胞系LNCaP、PC-3由本實驗室保存;帶有Flag標簽的雄激素受體(androgen receptor,AR),PXR表達載體,PXR下游基因CYP3A4啟動子區(qū)序列(XREM與PXRE區(qū)域)的螢光素酶報告基因載體XREM-Luc、PXRE-Luc,AR應答元件(andro?gen response element,ARE)報告基因載體(ARELuc)等由本實驗室保存[11-13];利福平(Rifampicin)購自Selleck公司;雄激素二氫睪酮(dihydrotestos?terone,DHT)購自Sigma公司;常規(guī)細胞培養(yǎng)試劑[DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)等]購自Hyclone公司;細胞培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板等實驗耗材購自Corning公司;1.5mLEP管購自Eppendorf公司;真核細胞轉(zhuǎn)染試劑Lipo?fectAMINE 2000為Invitrogen公司產(chǎn)品;Flagbeads、Flag抗體、乙腈(acetonitrile,ACN)及二甲亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)等為 Sigma公司產(chǎn)品;蛋白印跡實驗使用的化學發(fā)光試劑盒為北京天根公司產(chǎn)品;常規(guī)儀器均由本實驗室提供;液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用設(shè)備由中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所提供。

        1.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

        HEK293細胞于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)于添加10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液中;HepG2細胞于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)于添加10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中。在真核細胞轉(zhuǎn)染過程中,細胞培養(yǎng)至指數(shù)增長期,待其狀態(tài)良好時進行實驗,取0.5μLLipofectAMINE2000試劑與Flag-AR、Flag-PXR表達載體(用5μL無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)液充分溶解與稀釋)分別加入2個EP管中,每管添加24.5或20μL無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)基,充分混勻后室溫靜置15min,最后將2管液體等量混合,輕輕混勻后室溫靜置15 min即為轉(zhuǎn)染工作液。細胞換為無血清培養(yǎng)基,將配制所得轉(zhuǎn)染工作液輕輕、緩慢加入細胞中,37℃孵育4h后換液,用含10%FBS的培養(yǎng)液持續(xù)培養(yǎng)細胞。

        1.3 藥物配制

        用精密天平稱取藥物,用DMSO充分溶解藥物。對于小分子、蛋白結(jié)合實驗,藥物用DMSO溶解后,用生理鹽水稀釋,終濃度為1μmol/L;對于螢光素酶報告基因?qū)嶒?,用DMSO溶解利福平后,配制為10、3、1、0.3、0.1、0.03及 0.01mmol/L等系列濃度梯度的工作液,在進行實驗時稀釋,最終藥物作用于細胞的濃度為 10、3、1、0.3、0.1、0.03及0.01μmol/L,DMSO濃度約為1‰。

        1.4 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用實驗

        用乙腈配制利福平溶液,按照Dompreh等[14]的方法進行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測,表1列出具體的實驗/檢測條件。利福平相對分子質(zhì)量為823(母離子),在施加電壓后利福平離子被打碎,釋放出一個相對分子質(zhì)量約791的分子碎片(為子離子),以在這一過程中的利福平相對分子質(zhì)量變化(823/791)為其檢測特征。

        1.5 免疫共沉淀實驗

        在約2×108HEK293細胞中轉(zhuǎn)染Flag空載體、Flag-AR或Flag-PXR的表達載體48h后收集細胞并裂解,用高鹽的免疫共沉淀緩沖液進行免疫共沉淀實驗,用Flag-beads將Flag、Flag-AR或Flag-PXR蛋白從體系中分離出來。在此基礎(chǔ)上,將Flag-beads-蛋白復合物與1μmol/L利福平溶液于4℃孵育過夜。通過免疫印跡方法檢測Flagbeads-蛋白-利福平復合物中的Flag-AR與Flag-PXR,用液相色譜檢測復合物中的利福平。按照Ding等[15]的方法進行免疫印跡實驗,辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的Flag單克隆抗體稀釋為1∶5000。

        1.6 螢光素酶報告基因檢測

        PXR轉(zhuǎn)錄因子活性檢測:在HEK293細胞中轉(zhuǎn)染Flag-PXR表達載體以及螢光素酶報告基因表達載體XREM-Luc(含PXR下游基因CYP3A4增強子區(qū)域-7836/-7208序列)、PXRE-Luc(含PXR下游基因CYP3A4啟動子區(qū)域-362/+52序列);在HepG2細胞中轉(zhuǎn)染Flag-PXR表達載體以及螢光素酶報告基因表達載體XREM-Luc。

        表1 液相色譜-質(zhì)譜參數(shù)

        AR轉(zhuǎn)錄因子活性檢測:在PC-3細胞中轉(zhuǎn)染Flag-AR表達載體及螢光素酶報告基因ARE-Luc表達載體,在LNCaP細胞中轉(zhuǎn)染螢光素酶報告基因ARE-Luc表達載體。

        轉(zhuǎn)染實驗24h后收集細胞并裂解,依據(jù)Yang等的方法檢測報告基因的螢光素酶活性[16]。

        1.7 統(tǒng)計分析

        應用SPSS17.0軟件,采用單因素方差分析比較x±s,計算P值。

        2 結(jié)果

        2.1 用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測利福平

        結(jié)果如圖1,檢測到利福平的母離子/子離子對(Pair),表明建立了利福平的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法。

        2.2 Flag-PXR與Flag-AR的免疫共沉淀檢測

        結(jié)果如圖2,轉(zhuǎn)染Flag-PXR與Flag-AR的表達載體,能夠在HEK293細胞中表達相應融合蛋白;Flag-beads能夠從HEK293細胞體系中分離得到Flag-PXR與Flag-AR蛋白。這表明可以利用Flag-beads從HEK293細胞中免疫共沉淀Flag融合蛋白,并用免疫印跡實驗對Flag-beads-Flag蛋白復合物中的蛋白質(zhì)進行檢測。

        2.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測蛋白-小分子復合物中的利福平

        用乙腈將復合物中的利福平萃取出來,采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測,在特異性確證(利用特異性相對分子質(zhì)量的823/791離子對確證檢測到利福平)后,用質(zhì)譜掃描與記錄檢測到的823離子信號(圖3);在此基礎(chǔ)上,能夠從利福平溶液(In?put)中檢測到利福平的液-質(zhì)信號,從空載體(Flag)組、Flag-AR組微珠中無法檢測到利福平,而從Flag-PXR組微珠中能夠檢測到明確的利福平信號(圖4)。這表明,只有PXR而非Flag標簽或Flag-AR能夠與利福平相互作用。

        我們不得不承認,現(xiàn)代詩的進一步成就的學習不能僅僅依靠課堂上的幾十分鐘,現(xiàn)代詩的美和它的寫作藝術(shù)都是值得我們學習和考究的。戴望舒在《雨巷》的創(chuàng)作中,不僅將中國詩歌的典雅清韻運用得淋漓盡致,而且還將國外現(xiàn)代詩的精華與之結(jié)合,這無疑將現(xiàn)代詩向前推進了一大步。他的大膽和勇敢造就了他,也成就了《雨巷》,成為現(xiàn)代詩的絕唱,使得無數(shù)讀者被它的美所感染。

        2.4 利福平誘導PXR轉(zhuǎn)錄因子活性的螢光素酶報告基因活性檢測

        前述可知,PXR能夠與利福平相互作用。為確定利福平作用于PXR的特異性,利用螢光素酶報告基因活性實驗檢測利福平對PXR轉(zhuǎn)錄因子活性的影響,結(jié)果如圖5,利福平能夠劑量依賴地誘導PXR的轉(zhuǎn)錄因子活性。在此基礎(chǔ)上進一步檢測了利福平對AR轉(zhuǎn)錄因子活性的影響,結(jié)果如圖6,利福平不能誘導AR的轉(zhuǎn)錄因子活性。轉(zhuǎn)錄因子活性實驗結(jié)果驗證了小分子與核受體的相互作用。

        3 討論

        進展期肝細胞癌藥物研發(fā)與臨床診療面臨巨大挑戰(zhàn),闡明抗腫瘤藥物耐藥的機制,研究與開發(fā)逆轉(zhuǎn)耐藥的干預策略具有重要意義。我們的前期研究著眼于肝細胞癌自身的特性:肝臟是人體代謝的中心,而HCC細胞具有更為旺盛的物質(zhì)攝取和代謝特性,因此PXR介導的抗腫瘤藥物的代謝與清除機制可能是HCC對抗腫瘤藥物MDR的根本來源和特異性機制,最終發(fā)現(xiàn)與提出PXR的活化進而誘導抗腫瘤藥物代謝與清除,最終造成抗腫瘤藥物耐藥[3,17]。PXR的配體或激動劑是PXR活化所必需的,因此檢測與確證小分子化合物是否能夠與PXR結(jié)合并相互作用具有重要意義[7-8]。

        圖1 基于母離子/子離子對的利福平液相質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法

        盡管發(fā)現(xiàn)與鑒定PXR的潛在配體或激動劑具有重要意義,但這一研究也對現(xiàn)有實驗技術(shù)構(gòu)成巨大挑戰(zhàn)。對于傳統(tǒng)生化或細胞學研究者,可通過抗原-抗體識別等技術(shù)研究蛋白質(zhì)等生物大分子,通過PCR等特異性擴增目的核酸片段,但小分子化合物的研究與鑒定是難點。以螢光素酶報告基因等為代表的生化與細胞學研究技術(shù)僅能間接反映小分子對生物大分子的影響。最近被廣泛應用的SRP等技術(shù)雖然能夠檢測蛋白質(zhì)與小分子的相互作用,但設(shè)備要求很高且實驗費用昂貴,仍然是間接檢測:蛋白質(zhì)與小分子結(jié)合后,其構(gòu)象等性質(zhì)發(fā)生變化,通過生物-化學/生物-物理傳感器等檢測到蛋白性質(zhì)的變化,間接反應出蛋白與小分子的結(jié)合或相互作用。

        圖2 免疫共沉淀實驗檢測與識別Flag融合蛋白

        為進一步完善相關(guān)研究,本研究建立了基于免疫共沉淀-液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的PXR配體檢測方法:用免疫共沉淀與免疫印跡技術(shù)識別蛋白-小分子復合物中的蛋白質(zhì)組分,用LC-MS/MS技術(shù)識別蛋白-小分子復合物中的小分子化合物。在HEK3293細胞中表達得到帶有Flag標簽的目的蛋白Flag-PXR與Flag-AR,用Flag-beads將這些蛋白分離純化,再與利福平溶液孵育。用Flag抗體可對Flag-PXR、Flag-AR蛋白進行檢測,用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對復合物中的利福平進行識別。

        圖3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測利福平

        圖4 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測復合物中的利福平

        圖5 利福平對PXR轉(zhuǎn)錄因子活性檢測實驗

        圖6 利福平對AR轉(zhuǎn)錄因子活性檢測實驗

        作為低背景的細胞模型,HEK293細胞轉(zhuǎn)染效率很高,是研究的理想模型,結(jié)果特異性較高。免疫共沉淀相關(guān)技術(shù)是特異性檢測蛋白質(zhì)的常用技術(shù),同時免疫共沉淀系統(tǒng)對樣品有純化與富集作用,也更利于LC-MS/MS檢測。在此基礎(chǔ)上,聯(lián)合使用螢光素酶共沉淀實驗能夠?qū)π》肿幼饔玫奶禺愋赃M行驗證。值得一提的是,雄激素受體被用作無關(guān)對照,目前尚無利福平影響AR的報道,本研究中利福平不能與AR相互作用,也不能誘導AR的轉(zhuǎn)錄因子活性。綜上所述,我們建立了基于免疫共沉淀-液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的新型孕烷X受體配體檢測方法,能夠利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對蛋白質(zhì)-小分子復合物中的小分子化合物進行直接觀測,這不僅拓展了我們對大分子-小分子相互作用的研究,也對抗腫瘤藥物耐藥研究具有重要意義。

        參考文獻

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