霍雪萍，張琳萍，趙向絨，劉勤社，王海芳

1.陜西省人民醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710068；2.西安交通大學(xué) 醫(yī)學(xué)部中西醫(yī)結(jié)合專業(yè)，陜西 西安 710061；3.陜西省中西醫(yī)結(jié)合心血管病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 西安 712046

在研究分子機(jī)理時(shí)，檢測(cè)相關(guān)基因在mRNA水平的表達(dá)差異是重要環(huán)節(jié)，目前多采用實(shí)時(shí)定量 熒 光 PCR（quantitativereal-timePCR，qRTPCR）方法，具有定量準(zhǔn)確、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便及高通量等特點(diǎn)[1]。制備高質(zhì)量的RNA，選定表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因，對(duì)目的基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行校正，是獲得真實(shí)準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的前提。

核酸質(zhì)量的控制是對(duì)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果質(zhì)量控制的第一步。核酸在260nm處有最大吸收峰，蛋白質(zhì)在280nm處有最大吸收峰，鹽和小分子在230nm處有最大吸收峰。D260nm/D280nm和D260nm/D230nm是核酸純度的指示。高質(zhì)量RNA的D260nm/D280nm能達(dá)到 1.8～2.2，如果比值低于 1.8，表示存在蛋白質(zhì)或酚類物質(zhì)的影響；D260nm/D230nm值應(yīng)大于2.0，若比值小于2.0則表明樣品被糖類、鹽類或有機(jī)溶劑污染[2]。以往的研究關(guān)注D260nm/D280nm值對(duì)qRT-PCR結(jié)果的影響較多，而對(duì)D260nm/D230nm值的影響關(guān)注較少。

我們?cè)诶胵RT-PCR法檢測(cè)腫瘤壞死因子α（tumornecrosisfactor α，TNFα）調(diào)控下游細(xì)胞間黏附分子1（intercellularcelladhesionmolecule-1，ICAM-1）基因表達(dá)的研究中，發(fā)現(xiàn)RNA質(zhì)量對(duì)于內(nèi)參基因的選擇和基因表達(dá)水平的評(píng)價(jià)分析具有顯著影響。在此進(jìn)行報(bào)告，以期為相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（arterialendothelialcell，AEC）購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司；RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Clontech公司；細(xì)胞培養(yǎng)用青霉素/鏈霉素和胰蛋白酶購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；重組小鼠TNFα購(gòu)自北京義翹神州生物技術(shù)公司；總RNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理

小鼠AEC貼壁生長(zhǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2及飽和濕度的恒溫密閉細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，0.025%胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中長(zhǎng)滿（80%～90%）的AEC分為正常組和TNFα組。A批次的TNFα組為50 ng/mLTNFα誘導(dǎo)6h，B批次的TNFα組為30ng/mLTNFα誘導(dǎo)6h。

1.3 總RNA提取及cDNA合成

收集細(xì)胞，加入1mLTRIzol試劑，按說(shuō)明書(shū)實(shí)驗(yàn)流程提取細(xì)胞總RNA，用NanoDrop2000C紫外分光光度計(jì)（Thermoscientific公司）檢測(cè)總RNA濃度和純度，每個(gè)樣品上樣量為1μL。D260nm值作為RNA濃度測(cè)定的指標(biāo)（以ng/mL為單位），D260nm/D280nm和D260nm/D230nm比值作為RNA純度的指標(biāo)。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用PrimeScriptRTMaster Mix（PerfectRealTime）試劑盒（TaKaRa公司）。反轉(zhuǎn)錄體系為10μL，以500ng總RNA為起始材料，5×PrimeScriptRTMasterMix2 μL，無(wú) RNA酶水補(bǔ)足10μL。反轉(zhuǎn)錄條件：37℃ 15min，85℃ 5s，4℃保存。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

用NCBI軟件設(shè)計(jì)β-actin、GAPDH和ICAM-1引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物信息見(jiàn)表1。

1.5 qRT-PCR法檢測(cè)基因表達(dá)

用 SYBR Premix ExTaqⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒（TaKaRa公司）和ABI7500熒光PCR擴(kuò)增儀（Life公司）進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系：SYBR Premix ExTaqⅡ（TilR NaseH Plus）10 μL，模板 cDNA1 μL，正反引物各 0.5 μL，ddH2O8μL，總體系20μL。所有操作在冰上完成，每個(gè)樣品設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 5min，95℃變性 1min，58℃退火 45s，72℃延伸45s，在延伸階段進(jìn)行熒光信號(hào)采集，40個(gè)循環(huán)。分別以β-actin、GAPDH為內(nèi)參基因，計(jì)算同一樣本中目的基因與內(nèi)參基因的含量比值，評(píng)價(jià)目的基因表達(dá)水平。

表1 引物信息

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

從ABI7500熒光定量PCR儀中導(dǎo)出閾值循環(huán)數(shù)（Ct），換算各基因的相對(duì)表達(dá)量為 2-ΔΔct，采用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 RNA質(zhì)量評(píng)價(jià)

用NanoDrop2000C紫外分光光度計(jì)對(duì)RNA的濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)。A組樣品RNA的D260nm/D280nm為 1.8～2.2，D260nm/D230nm＞2.0，表 明 該 組 樣 品RNA純度好；B組樣品RNA的D260nm/D280nm為1.8～2.2，D260nm/D230nm＜2.0，表明該組樣品可能被碳水化合物（糖類）、鹽類或有機(jī)溶劑污染。見(jiàn)表2。

2.2 qRT-PCR基因檢測(cè)結(jié)果

以1μLcDNA作為qRT-PCR的起始模板，確保cDNA大致相同的拷貝數(shù)，以保證后續(xù)結(jié)果具有可比性。圖1為內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的溶解曲線，出現(xiàn)單一的信號(hào)峰，說(shuō)明沒(méi)有引物二聚體和非特異性條帶產(chǎn)生，引物設(shè)計(jì)合理，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，滿足實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)引物的要求。表3為A、B批次樣品PCR反應(yīng)中2種內(nèi)參基因及目的基因ICAM-1的mRNA表達(dá)水平。A批次樣品β-actin和GAPDH基因的Ct值小于20，2個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)量均較高且一致性好；B批次樣品β-actin基因的Ct值大于20，GAPDH基因的Ct值小于20，組內(nèi)一致性均較好。以上數(shù)據(jù)表明實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程無(wú)誤，數(shù)據(jù)可信度高。

表2 RNA質(zhì)量對(duì)照表

2.3 qRT-PCR結(jié)果分析

采用 2-ΔΔct法對(duì) ICAM-1 的 mRNA 水平進(jìn)行相對(duì)定量分析。A批次，采用2種內(nèi)參基因進(jìn)行相對(duì)定量，TNFα組的ICAM-1mRNA表達(dá)水平非常接近；B批次，以β-actin和以GAPDH作為內(nèi)參基因?qū)CAM-1相對(duì)定量，TNFα組的表達(dá)水平差別近30倍（表4）。

圖1 基因熔解曲線

表3 qRT-PCR基因檢測(cè)結(jié)果（Ct值）

表4 內(nèi)參基因?qū)δ繕?biāo)基因表達(dá)結(jié)果分析的影響

3 討論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是分析基因表達(dá)的一種有效方法，但分析結(jié)果會(huì)受RNA質(zhì)量、RNA反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增效率等多種因素的影響[3]。為了避免這類誤差的產(chǎn)生，在分析目標(biāo)基因的表達(dá)量時(shí)，須選擇表達(dá)穩(wěn)定性較高的內(nèi)參基因作為校正標(biāo)準(zhǔn)。然而，任何一種內(nèi)參基因的所謂穩(wěn)定表達(dá)都是在一定類型的細(xì)胞或?qū)嶒?yàn)因素作用下在一定范圍內(nèi)的恒定，并非絕對(duì)的穩(wěn)定表達(dá)[4]。許多研究證實(shí)理想的內(nèi)參基因并不存在，不同的處理因素以及不同組織中內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性是不一致的[5-6]。因此，在利用qRT-PCR進(jìn)行基因表達(dá)的研究時(shí)，應(yīng)根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)樣品選用合適的內(nèi)參基因。

TNFα是機(jī)體急、慢性炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞因子，能夠誘導(dǎo)多種黏附分子的表達(dá)，促進(jìn)單核細(xì)胞浸潤(rùn)，參與炎癥病理進(jìn)程。ICAM-1是公認(rèn)的血管炎性疾病標(biāo)志物之一。我們發(fā)現(xiàn)在研究TNFα作用的文獻(xiàn)中，有關(guān)ICAM-1分子水平的檢測(cè)大多采用β-actin作為內(nèi)參基因。我們采用2種常用內(nèi)參基因GAPDH和β-actin進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，RNA質(zhì)量對(duì)于內(nèi)參基因的選擇和qRT-PCR結(jié)果評(píng)價(jià)具有重要意義。RNA的D260nm/D280nm和D260nm/D230nm比值都應(yīng)當(dāng)加以考慮。當(dāng)核酸D260nm/D280nm在正常范圍內(nèi)，D260nm/D230nm＞2.0，即RNA純度很高時(shí)，采用2種內(nèi)參對(duì)于目的基因ICAM-1的相對(duì)表達(dá)量評(píng)價(jià)結(jié)果相近；如果D260nm/D230nm＜2.0，即RNA純度不高時(shí)，采用不同內(nèi)參對(duì)于ICAM-1基因的相對(duì)表達(dá)量評(píng)估存在很大差異，比較而言，此時(shí)選用GAPDH內(nèi)參評(píng)價(jià)結(jié)果的可信度更高。因此，在進(jìn)行TNFα的相關(guān)分子研究以及對(duì)珍稀樣品進(jìn)行生物學(xué)研究時(shí)，應(yīng)針對(duì)核酸質(zhì)量選擇合適的內(nèi)參基因進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，必要情況下可選擇至少2個(gè)內(nèi)參，綜合分析，得出可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。