霍雪萍，張琳萍，趙向絨，劉勤社，王海芳

1.陜西省人民醫(yī)院 中心實驗室，陜西 西安 710068；2.西安交通大學 醫(yī)學部中西醫(yī)結(jié)合專業(yè)，陜西 西安 710061；3.陜西省中西醫(yī)結(jié)合心血管病防治重點實驗室，陜西中醫(yī)藥大學，陜西 西安 712046

在研究分子機理時，檢測相關基因在mRNA水平的表達差異是重要環(huán)節(jié)，目前多采用實時定量 熒 光 PCR（quantitativereal-timePCR，qRTPCR）方法，具有定量準確、靈敏度高、快速簡便及高通量等特點[1]。制備高質(zhì)量的RNA，選定表達穩(wěn)定的內(nèi)參基因，對目的基因的相對表達量進行校正，是獲得真實準確的實驗數(shù)據(jù)的前提。

核酸質(zhì)量的控制是對qRT-PCR實驗結(jié)果質(zhì)量控制的第一步。核酸在260nm處有最大吸收峰，蛋白質(zhì)在280nm處有最大吸收峰，鹽和小分子在230nm處有最大吸收峰。D260nm/D280nm和D260nm/D230nm是核酸純度的指示。高質(zhì)量RNA的D260nm/D280nm能達到 1.8～2.2，如果比值低于 1.8，表示存在蛋白質(zhì)或酚類物質(zhì)的影響；D260nm/D230nm值應大于2.0，若比值小于2.0則表明樣品被糖類、鹽類或有機溶劑污染[2]。以往的研究關注D260nm/D280nm值對qRT-PCR結(jié)果的影響較多，而對D260nm/D230nm值的影響關注較少。

我們在利用qRT-PCR法檢測腫瘤壞死因子α（tumornecrosisfactor α，TNFα）調(diào)控下游細胞間黏附分子1（intercellularcelladhesionmolecule-1，ICAM-1）基因表達的研究中，發(fā)現(xiàn)RNA質(zhì)量對于內(nèi)參基因的選擇和基因表達水平的評價分析具有顯著影響。在此進行報告，以期為相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠動脈內(nèi)皮細胞（arterialendothelialcell，AEC）購自上海拜力生物科技有限公司；RPMI-1640細胞培養(yǎng)基和胎牛血清購自Clontech公司；細胞培養(yǎng)用青霉素/鏈霉素和胰蛋白酶購自碧云天生物技術研究所；重組小鼠TNFα購自北京義翹神州生物技術公司；總RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及藥物處理

小鼠AEC貼壁生長于含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2及飽和濕度的恒溫密閉細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，0.025%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。將6孔細胞培養(yǎng)板中長滿（80%～90%）的AEC分為正常組和TNFα組。A批次的TNFα組為50 ng/mLTNFα誘導6h，B批次的TNFα組為30ng/mLTNFα誘導6h。

1.3 總RNA提取及cDNA合成

收集細胞，加入1mLTRIzol試劑，按說明書實驗流程提取細胞總RNA，用NanoDrop2000C紫外分光光度計（Thermoscientific公司）檢測總RNA濃度和純度，每個樣品上樣量為1μL。D260nm值作為RNA濃度測定的指標（以ng/mL為單位），D260nm/D280nm和D260nm/D230nm比值作為RNA純度的指標。反轉(zhuǎn)錄反應采用PrimeScriptRTMaster Mix（PerfectRealTime）試劑盒（TaKaRa公司）。反轉(zhuǎn)錄體系為10μL，以500ng總RNA為起始材料，5×PrimeScriptRTMasterMix2 μL，無 RNA酶水補足10μL。反轉(zhuǎn)錄條件：37℃ 15min，85℃ 5s，4℃保存。

1.4 引物設計與合成

用NCBI軟件設計β-actin、GAPDH和ICAM-1引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物信息見表1。

1.5 qRT-PCR法檢測基因表達

用 SYBR Premix ExTaqⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒（TaKaRa公司）和ABI7500熒光PCR擴增儀（Life公司）進行熒光定量PCR檢測。PCR反應體系：SYBR Premix ExTaqⅡ（TilR NaseH Plus）10 μL，模板 cDNA1 μL，正反引物各 0.5 μL，ddH2O8μL，總體系20μL。所有操作在冰上完成，每個樣品設立3個復孔。反應條件：95℃預變性 5min，95℃變性 1min，58℃退火 45s，72℃延伸45s，在延伸階段進行熒光信號采集，40個循環(huán)。分別以β-actin、GAPDH為內(nèi)參基因，計算同一樣本中目的基因與內(nèi)參基因的含量比值，評價目的基因表達水平。

表1 引物信息

1.6 統(tǒng)計學方法

從ABI7500熒光定量PCR儀中導出閾值循環(huán)數(shù)（Ct），換算各基因的相對表達量為 2-ΔΔct，采用Excel軟件進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果

2.1 RNA質(zhì)量評價

用NanoDrop2000C紫外分光光度計對RNA的濃度和純度進行檢測。A組樣品RNA的D260nm/D280nm為 1.8～2.2，D260nm/D230nm＞2.0，表 明 該 組 樣 品RNA純度好；B組樣品RNA的D260nm/D280nm為1.8～2.2，D260nm/D230nm＜2.0，表明該組樣品可能被碳水化合物（糖類）、鹽類或有機溶劑污染。見表2。

2.2 qRT-PCR基因檢測結(jié)果

以1μLcDNA作為qRT-PCR的起始模板，確保cDNA大致相同的拷貝數(shù)，以保證后續(xù)結(jié)果具有可比性。圖1為內(nèi)參基因和目標基因的溶解曲線，出現(xiàn)單一的信號峰，說明沒有引物二聚體和非特異性條帶產(chǎn)生，引物設計合理，結(jié)果準確可靠，滿足實時熒光定量PCR對引物的要求。表3為A、B批次樣品PCR反應中2種內(nèi)參基因及目的基因ICAM-1的mRNA表達水平。A批次樣品β-actin和GAPDH基因的Ct值小于20，2個內(nèi)參基因的表達量均較高且一致性好；B批次樣品β-actin基因的Ct值大于20，GAPDH基因的Ct值小于20，組內(nèi)一致性均較好。以上數(shù)據(jù)表明實驗操作過程無誤，數(shù)據(jù)可信度高。

表2 RNA質(zhì)量對照表

2.3 qRT-PCR結(jié)果分析

采用 2-ΔΔct法對 ICAM-1 的 mRNA 水平進行相對定量分析。A批次，采用2種內(nèi)參基因進行相對定量，TNFα組的ICAM-1mRNA表達水平非常接近；B批次，以β-actin和以GAPDH作為內(nèi)參基因?qū)CAM-1相對定量，TNFα組的表達水平差別近30倍（表4）。

圖1 基因熔解曲線

表3 qRT-PCR基因檢測結(jié)果（Ct值）

表4 內(nèi)參基因?qū)δ繕嘶虮磉_結(jié)果分析的影響

3 討論

實時熒光定量PCR是分析基因表達的一種有效方法，但分析結(jié)果會受RNA質(zhì)量、RNA反轉(zhuǎn)錄、擴增效率等多種因素的影響[3]。為了避免這類誤差的產(chǎn)生，在分析目標基因的表達量時，須選擇表達穩(wěn)定性較高的內(nèi)參基因作為校正標準。然而，任何一種內(nèi)參基因的所謂穩(wěn)定表達都是在一定類型的細胞或?qū)嶒炓蛩刈饔孟略谝欢ǚ秶鷥?nèi)的恒定，并非絕對的穩(wěn)定表達[4]。許多研究證實理想的內(nèi)參基因并不存在，不同的處理因素以及不同組織中內(nèi)參基因表達的穩(wěn)定性是不一致的[5-6]。因此，在利用qRT-PCR進行基因表達的研究時，應根據(jù)不同的實驗條件、實驗樣品選用合適的內(nèi)參基因。

TNFα是機體急、慢性炎癥反應的重要細胞因子，能夠誘導多種黏附分子的表達，促進單核細胞浸潤，參與炎癥病理進程。ICAM-1是公認的血管炎性疾病標志物之一。我們發(fā)現(xiàn)在研究TNFα作用的文獻中，有關ICAM-1分子水平的檢測大多采用β-actin作為內(nèi)參基因。我們采用2種常用內(nèi)參基因GAPDH和β-actin進行研究時發(fā)現(xiàn)，RNA質(zhì)量對于內(nèi)參基因的選擇和qRT-PCR結(jié)果評價具有重要意義。RNA的D260nm/D280nm和D260nm/D230nm比值都應當加以考慮。當核酸D260nm/D280nm在正常范圍內(nèi)，D260nm/D230nm＞2.0，即RNA純度很高時，采用2種內(nèi)參對于目的基因ICAM-1的相對表達量評價結(jié)果相近；如果D260nm/D230nm＜2.0，即RNA純度不高時，采用不同內(nèi)參對于ICAM-1基因的相對表達量評估存在很大差異，比較而言，此時選用GAPDH內(nèi)參評價結(jié)果的可信度更高。因此，在進行TNFα的相關分子研究以及對珍稀樣品進行生物學研究時，應針對核酸質(zhì)量選擇合適的內(nèi)參基因進行qRT-PCR實驗，必要情況下可選擇至少2個內(nèi)參，綜合分析，得出可靠的實驗結(jié)果。