董周寰，張晶，王哲，許程程，王芳，宋海峰，付潔，石懷銀

1.解放軍總醫(yī)院 病理科，北京 100853；2.軍事科學院 軍事醫(yī)學研究院 生命組學研究所，蛋白質(zhì)藥物國家工程研究中心，北京 102206；3.北京金則醫(yī)學科技發(fā)展有限公司，北京 102206；4.軍科正源（北京）藥物研究有限責任公司，北京 102206

人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2，又稱 ERBB2）是人表皮生長因子家族成員，其基因位于17號染色體。HER2過表達是促發(fā)多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，也是靶向治療選擇的關(guān)鍵指標之一[1-3]，抗體藥物赫賽汀可有效治療約25%的HER2高表達型乳腺癌[4]。研究表明，除乳腺癌外，胃癌等癌癥中HER2基因拷貝數(shù)會發(fā)生變異[5-6]，因此準確考察HER2基因拷貝數(shù)變化（copy number varia?tion，CNV），對于靶向治療意義重大。

目前臨床上常通過免疫組化（immunohisto?chemistry，IHC）和熒光免疫雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）的方法進行靶點確證，判斷患者疾病進程，但研究表明HER2檢測有10%～20%結(jié)果無法準確反映[7]，主要因素為：①操作者技術(shù)水平影響；②結(jié)果評判存在主觀性；③腫瘤的異質(zhì)性導致取樣偏差[7-8]。另外，F(xiàn)ISH是用探針檢測切片樣品中HER2、CEP-17的信號，通過HER2、CEP-17熒光信號的比值來評價HER2的擴增程度，但有文獻報道CEP-17本身可能也會異常擴增[9]，僅以其作為內(nèi)參基因可能會導致部分患者不能受益于HER2靶向治療。

雖然FISH是目前檢測HER2CNV的金標準，但由于上述局限性，以及通量低成本較高，仍需要更為準確、客觀、較高通量、成本較低的檢測技術(shù)加以輔助甚至替代。數(shù)字PCR（droplet digi?talPCR，ddPCR）是目前最具潛力的檢測方法之一，早在20世紀90年代就有科學家提出ddPCR的概念[10-12]。近幾年，ddPCR在微生物[13]、拷貝數(shù)變異[14]、基因突變[15]等分析領(lǐng)域有突破性貢獻。ddPCR是組織提取后勻質(zhì)狀態(tài)下靶分子的絕對定量技術(shù)，具有很高的靈敏度與準確性[16]。我們將ddPCR用于HER2CNV檢測，并與IHC、FISH結(jié)果進行比較，希望將ddPCR發(fā)展為IHC、FISH檢測的有力補充手段之一。

1 材料與方法

1.1 材料

收集解放軍總醫(yī)院2015年3～7月經(jīng)病理確診為乳腺癌的福爾馬林固定石蠟包埋（formalinfixed and parrffin-embedded，F(xiàn)FPE）樣本 21例，其中IHC結(jié)果顯示為“++”樣品18例，“+++”樣品3例。該批樣本均經(jīng)FISH方法檢測HER2CNV。

FFPE樣品DNA提取試劑盒購自凱杰公司；細胞基因組DNA（gDNA）提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；ddPCR探針法自動化微滴發(fā)生油、檢測預混液分析專用油購自Bio-Rad公司；HER2和CEP-17的DNA檢測引物探針序列由本實驗室參考文獻[17]及NCBIGenBank數(shù)據(jù)庫后利用軟件Prime5.0設(shè)計（表1），由上海生工公司合成；HER2IHC檢測一抗為兔IgG，購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司，克隆號EP3；二抗檢測系統(tǒng)為羅氏Ventana公司的UltraView Universal DABDetection試劑盒；FISH檢測使用乳腺癌HER2基因檢測試劑盒（FISH法）（PathVysion）。

表1HER2及CEP-17引物探針序列

Bio-RadQX200自動化數(shù)字PCR系統(tǒng)（微滴生成儀器，微滴讀取儀器，T100PCR儀，熱封儀）；Thermo臺式離心機等實驗室常規(guī)儀器。

1.2 標本核酸提取

21例FFPE樣本經(jīng)石蠟包埋后切片用于IHC及FISH檢測判斷患者病理情況，同時每個組織再切2片，厚度均為5μm，置于1.5mL無核酸酶EP管中，室溫保存。用凱杰公司FFPE樣品DNA提取試劑盒提取樣品gDNA，用NanoDrop檢測濃度、純度后以10μL/管分裝保存于-60℃～-90℃冰箱。

1.3 細胞系DNA提取

HER2表達正常型細胞系人胚腎細胞293T、人口腔上皮細胞HOEC，以及HER2陽性表達卵巢癌細胞系SKOV3購于ATCC并保存于本實驗室，收集對數(shù)生長期細胞，用細胞gDNA提取試劑盒提取gDNA，并經(jīng)NanoDrop檢測濃度、純度后10 μL/管分裝，-60℃～-90℃保存。

1.4HER2、CEP-17ddPCR檢測方法建立

設(shè)計、合成HER2、CEP-17引物探針，以293T、HOEC、SKOV3細胞gDNA為模板建立反應體系及程序。ddPCR反應體系包括Supermix 10 μL，上、下游引物各 0.8 μmol/L，探針 0.25 μmol/L，DEPC水 4.3 μL，gDNA40ng/2 μL。將反應體系配置在96孔板后，在Bio-Rad自動化數(shù)字PCR微滴生成儀中生成微滴，封板后在普通PCR儀上進行擴增（擴增程序：95℃ 5min；94℃30s，60℃ 40s，40個循環(huán)；98℃ 10min）。擴增畢，用微滴分析儀及QuantaSoft軟件分析結(jié)果，得到每個樣品中HER2、CEP-17基因的拷貝數(shù)。

1.5 線性稀釋

將293T細胞gDNA用DEPC水稀釋至20ng/μL，并按1/5梯度稀釋為5個濃度水平，上樣量均為 2 μL/反應，即上樣量分別為 40、8、1.6、0.32、0.064ng/反應。按1.4中的反應體系及程序配置ddPCR樣品并進行檢測。

1.6 單通道、雙通道檢測方法比較

以梯度稀釋的293T細胞gDNA為模板建立雙通道反應體系（上樣量分別為40、8、1.6、0.32ng/反應），即HER2、CEP-17引物和探針于同管反應。同時從IHC檢測結(jié)果為“++”和“+++”的樣品中各隨機挑選1個（最終選擇樣本為9#、14#），制備CEP-17（FAM，藍色）及HER2（VIC，綠色）單通道反應體系和雙通道反應體系，反應程序與1.4中描述相同。

1.7 標本樣品ddPCR檢測

所有樣品均采用雙通道檢測法檢測，以Ratio（HER2/CEP-17）表述樣品中的HER2CNV。

1.8 標本樣品IHC及FFPE檢測

IHC檢測流程：石蠟切片脫蠟至水；pH9.0 EDTA溶液修復1h；3%H2O2室溫孵育10min以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；蒸餾水沖洗，PBS浸泡；滴加一抗工作液，37℃孵育1h；PBS沖洗3次；按說明書進行二抗孵育及顯色；自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。

FISH檢測按試劑盒說明書進行。

2 結(jié)果

2.1 細胞系HER2/CEP-17檢測結(jié)果

HER2正常表達型293T細胞和HOEC細胞HER2/CEP-17值分別為 1.20（8020/6700）和 1.24（7880/6360），SKOV3細胞HER2/CEP-17值為4.83（22010/4560）。

2.2 線性稀釋結(jié)果

為考察引物、探針響應性，以293T細胞gDNA樣品系列稀釋模板做線性考察，結(jié)果表明R2＞0.99，2種基因引物探針符合檢測要求，典型的ddPCR結(jié)果見圖1。

2.3 單通道、雙通道檢測結(jié)果

293T細胞gDNA稀釋至1/5，分別用CEP-17和HER2引物探針進行單通道、雙通道檢測，以考察引物探針PCR反應性能。如圖2，單、雙通道結(jié)果一致，線性R2＞0.99，引物、探針符合ddPCR檢測要求，且在1個反應孔中進行2種靶基因的擴增不會相互干擾。9#、14#樣品的單、雙通道檢測結(jié)果顯示HER2/CEP-17值精密度高（CV分別為2.4%、3.1%）。

2.4 ddPCR檢測結(jié)果界定

鑒于293T、HOEC細胞系中HER2/CEP-17值為1.2，結(jié)合ddPCR的技術(shù)原理，本研究中對標本樣本暫定為：當HER2、CEP-17其中之一拷貝數(shù)≥20000時，須降低上樣量重測；在此基礎(chǔ)上，當樣本HER2/CEP-17值≥2.1時為HER2擴增陽性，當樣本2.1＞HER2/CEP-17值≥1.2時為HER2臨界陽性，當樣本HER2/CEP-17值＜1.2時為HER2擴增陰性。

2.5 FISH檢測結(jié)果

參照ASCO/CAP公布的2013版HER2檢測指南，本研究根據(jù)FISH檢測對HER2CNV的評判標準如下：①當HER2/CEP-17比值≥2.0時，為HER2陽性；HER2/CEP-17比值＜2.0，但平均拷貝數(shù)/細胞≥6.0時也為HER2陽性；②若眾多信號連接成簇時可不計算，視為基因擴增；③HER2/CEP-17比值＜2.0且平均拷貝數(shù)/細胞＜4.0時為HER2陰性；④HER2/CEP-17比值＜2.0且平均拷貝數(shù)/細胞≥4.0但＜6.0，F(xiàn)ISH不確定；⑤HER2/CEP-17比值≥2.0，但平均拷貝數(shù)/細胞＜4.0的病例是否該視為陽性，目前存在一定爭議。本研究所取樣本的FISH結(jié)果均為＞2.0的樣本為陽性，＜2.0的樣本為陰性。關(guān)鍵樣本FISH結(jié)果如圖3，F(xiàn)ISH染色后，用奧林帕斯顯微鏡BX53觀測（目鏡10×，油鏡100×），攝像頭DP70拍照。

2.6 ddPCR、IHC、FISH結(jié)果比較

將同一樣品3種檢測平臺所得結(jié)果統(tǒng)一比較（表2）。在14例IHC檢測為“++”、FISH檢測小于2.0的樣品中，13例ddPCR檢測陰性，1例（2#）臨界陽性，但該例樣本的FISH檢測結(jié)果為1.96，接近FISH的陽性判斷標準。在3例IHC檢測為“+++”、FISH檢測為陽性的樣本中，2例ddPCR檢測為陽性，1例（17#）檢測臨界陽性。還有2例IHC檢測為“++”的樣品，F(xiàn)ISH檢測為陽性，但ddPCR檢測為陰性。

圖1 典型CEP-17（A）和HER2（B）ddPCR結(jié)果圖

圖2 293T細胞DNA單通道（A）和雙通道（B）檢測結(jié)果及HER2/CEP-17值

圖3 典型FISH陰性（A）和陽性（B）結(jié)果

表2 IHC、FISH及ddPCR結(jié)果比較

3 討論

ddPCR與實時定量PCR技術(shù)原理相同，通過酶、引物、探針等對靶基因進行擴增并轉(zhuǎn)化成可用于定量的數(shù)值。與實時定量PCR“一鍋反應”不同的是，ddPCR主要通過微滴生成或芯片將反應體系分成 1×104～2×104個微滴，以形成一個個微小的獨立反應器，數(shù)據(jù)分析時直接給出每個樣品中靶基因的拷貝數(shù)，對于微量拷貝數(shù)的定量更為準確。ddPCR與所有PCR實驗一樣，在實驗過程中須嚴格操作，保證環(huán)境、樣品不被氣溶膠污染。在ddPCR的引物篩選及條件優(yōu)化中，我們常選擇陰性、陽性微滴信號分布相對集中且間隔較大情況下對應的體系及程序。同時，數(shù)據(jù)分析中，需要用陰性對照劃閾值線判定陰、陽性微滴，與實時定量PCR不同的是，ddPCR可結(jié)合分析批中陰性對照設(shè)置的數(shù)量及檢測的結(jié)果通過軟件計算出分析批的陽性Cut-off值，只有大于Cut-off值的樣品才真正含有靶基因，小于Cut-off值的樣品為弱陽性/假陽性，陽性微滴的產(chǎn)生可能源于污染或系統(tǒng)誤差等，可選擇重測（主要看實驗者如何設(shè)計實驗）。但還需要同時考察樣品陽性微滴所在的信號范圍，如果僅是在閾值線的上方，遠達不到陽性對照樣品中陽性微滴的信號值，則須更加科學地分析這些微滴是否是真的“陽性”。

為對樣品前處理回收率、ddPCR檢測上樣量進行歸一，我們以HER2同一染色體上的CEP-17為對照，采用HER2/CEP-17的形式進行報告，排除切片質(zhì)量、提取回收效率等因素的干擾。雖然HER2/CEP-17是FISH中HER2檢測的金標準，但我們不能僅依靠CEP-17來判斷17號染色體的數(shù)目[8,18-20]。在檢測樣品時，應盡量保證相同的切片數(shù)量、處理方法、ddPCR體系和程序，在分析結(jié)果的過程中關(guān)注CEP-17和HER2各自的拷貝數(shù)，及時發(fā)現(xiàn)異常，科學地分析數(shù)據(jù)。本研究ddPCR分析結(jié)果表明，在切片數(shù)量和DNA上樣量一致的前提下，CEP-17拷貝數(shù)變化范圍為幾百至幾千拷貝，說明存在樣本核酸片段化差異顯著情況或者異常擴增的情況。該現(xiàn)象提示我們，ddPCR檢測應用于臨床前需要對FFPE樣品保存和樣本前處理進一步優(yōu)化，甚至可用新鮮凍存樣本。此外，ddPCR可能需要參比多個內(nèi)參基因排除CEP-17異常擴增的問題。

本研究中我們檢測了21例樣品，初步得到用ddPCR法檢測HER2CNV（HER2/CEP-17比值）的Cut-off值范圍，并且與FISH陰性樣品的一致性為13/14，陽性結(jié)果完全一致性為2/7（其他5例FISH陽性的樣本中，3例ddPCR檢測為臨界陽性，2例為陰性，其FISH檢測結(jié)果分別為2.1、2.3）。從上述結(jié)果比對中可見，腫瘤的異質(zhì)性可能導致FISH或ddPCR取樣或結(jié)果判讀存在一定的主觀因素，特別是對臨界陽性的樣本。我們?nèi)皂毨^續(xù)增加樣本量，并盡量追蹤FISH檢測與ddPCR檢測不一致的個體的其他檢測結(jié)果，甚至后期疾病進展情況，以建立ddPCR從FFPE切片樣品中檢測HER2CNV與IHC進程的參數(shù)，成為輔助IHC、FISH用于臨床研究及診斷的檢測手段。