董寧，丁良，戴姍姍，郭青玉

陜西省顱頜面精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西省牙頜面疾病臨床研究中心，西安交通大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院兒童口腔科，陜西 西安 710004

牙髓受到齲病等各種刺激會(huì)觸發(fā)自身的防御和修復(fù)功能而呈現(xiàn)應(yīng)答反應(yīng)，隨后通過各種細(xì)胞因子介導(dǎo)的一系列復(fù)雜的細(xì)胞、蛋白、細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)修復(fù)損傷、重建組織，其具體機(jī)制尚不清楚且難以進(jìn)行外源性操控[1]?；蚪M篩選和芯片等高通量技術(shù)的不斷發(fā)展豐富，為我們提供了一個(gè)獲取齲病分子水平信息的研究利器。我們綜合利用生物信息學(xué)工具，對(duì)正常和齲壞牙髓的相關(guān)基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并對(duì)齲病相關(guān)差異表達(dá)基因進(jìn)行初步篩選，為下一步研究提供線索。

1 材料和方法

1.1 材料

研究數(shù)據(jù)取自齲壞牙髓相關(guān)基因表達(dá)芯片（GSE1629），下載自美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omni?bus，GEO），由 McLachlan等提交，實(shí)驗(yàn)平臺(tái)是 Af?fymetrix公司的HG-U133A芯片。共4組樣本，齲壞 牙 髓（GSM27725、GSM27726）和 正 常 牙 髓（GSM27727、GSM2778）各2組。樣本取自12顆臨床診斷健康及11顆臨床診斷為深齲（牙本質(zhì)深層未穿髓、無炎癥）的因正畸原因拔除的前磨牙或磨牙，患者年齡 20～30 歲[2]。

1.2 差異基因分析及篩選

用在線分析工具M(jìn)ORPHEUS（https://software.broadinstitute.org/morpheus/）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。樣本按齲壞和正常分為2組，進(jìn)行比較，以P＜0.05、差異表達(dá)倍數(shù)（foldchange）≥2作為差異基因的篩選條件。

1.3 差異基因的基因本體論（geneontology，GO）富集分析和通路分析

將篩選出的上調(diào)及下調(diào)差異基因列表導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/），利用生物學(xué)注釋進(jìn)行相關(guān)的GO富集分析（生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞組成）和KEGG通路分析[3-4]。設(shè)定P＜0.05、FDR＜0.05，進(jìn)行篩選匹配。

1.4 差異基因編碼蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)和節(jié)點(diǎn)分析

將差異基因?qū)隨TRINGv10.0（http://string.Db.org/）[5]，分析其所編碼的蛋白之間的相互作用，找出關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的蛋白質(zhì)，綜合分?jǐn)?shù)（combined score）＞0.4定為有效篩選標(biāo)準(zhǔn)。隨后用Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（protein-proteininterac?tion，PPI）網(wǎng)絡(luò)，用其 MCODE（MolecularComplex Detection）插件深入篩檢其中關(guān)聯(lián)性強(qiáng)的蛋白互作模塊，標(biāo)準(zhǔn)為分?jǐn)?shù)大于4，節(jié)點(diǎn)數(shù)和互作數(shù)不少于10個(gè)。

2 結(jié)果

2.1 差異基因

共篩選出齲壞牙髓差異表達(dá)基因375個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)253個(gè)，表達(dá)下調(diào)122個(gè)（圖1A）。

2.2 差異基因的GO富集分析

結(jié)果見表1（按P值高低排名，部分展示）。篩選出的上調(diào)基因主要富集在生物學(xué)過程（bio?logicalprocess，BP）201個(gè)分類（免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子應(yīng)答和細(xì)胞活化調(diào)控等）、分子功能（molecularfunction，MF）14個(gè)分類（抗原結(jié)合、受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性和分子傳感活性等）、細(xì)胞組分（cellcomponent，CC）26個(gè)分類（胞外間隙、主要組織相容性復(fù)合體、膜結(jié)合囊泡和溶酶體等）；下調(diào)基因主要富集于6個(gè)BP分類（生物礦化組織發(fā)育、細(xì)胞突起形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞組分形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞突起組建、細(xì)胞黏附和生物附著）和2個(gè)CC分類（蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)）。

2.3 KEGG通路分析

按設(shè)定條件篩選后，上調(diào)差異基因所涉及的KEGG通路分析有17條被保留，包括金黃色葡萄球菌感染、吞噬體、抗原加工提呈及NF-κB信號(hào)通路等（表2，部分展示）。下調(diào)基因未有有效涉及通路獲得保留。

圖1 差異表達(dá)基因分析

2.4 差異基因編碼蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

STRING檢測(cè)結(jié)果顯示，上調(diào)基因PPI網(wǎng)絡(luò)共涵蓋195個(gè)節(jié)點(diǎn)蛋白和411個(gè)蛋白互作（圖1B），下調(diào)基因PPI網(wǎng)絡(luò)共涵蓋105個(gè)節(jié)點(diǎn)蛋白和62個(gè)蛋白互作（圖 1C）。其中 MMP9、CXCL12、IL-8、PTPRC、LYN、CXCR4、CD44、CXCL1、SERPINA1、CTSS蛋白的互作多于10條，被認(rèn)為是中心節(jié)點(diǎn)基因且均為上調(diào)基因（表3）。MCODE分析得到2個(gè)高顯著性蛋白互作模塊，均處于上調(diào)差異基因互作網(wǎng)絡(luò)中（圖1D）。

3 討論

牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的內(nèi)生性修復(fù)再生是機(jī)體防御齲病的重要手段，其機(jī)制亦是近年來的研究熱點(diǎn)，其中涉及的分子和細(xì)胞相互作用非常復(fù)雜，若能控制炎癥損傷與再生之間的平衡，將促進(jìn)牙髓組織愈合[6]。本研究綜合應(yīng)用生物信息學(xué)工具，篩選得到牙髓組織中與齲病發(fā)生相關(guān)的差異基因，并通過構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)深入發(fā)掘出齲病相關(guān)性高的核心基因，富集分析結(jié)果顯示這些基因可能加強(qiáng)了病理狀態(tài)下組織的免疫應(yīng)答和抗原抗體反應(yīng)，同時(shí)活化了炎癥相關(guān)細(xì)胞因子并調(diào)控機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)。同時(shí)由于組織受到破壞，部分生物礦化因子及細(xì)胞形態(tài)發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)亦受到抑制。

表1 齲齒牙髓GO富集分析結(jié)果

表2 齲壞牙髓中上調(diào)差異基因涉及的KEGG通路分析結(jié)果

表3 差異基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中心節(jié)點(diǎn)基因

其中多數(shù)表達(dá)上調(diào)的細(xì)胞因子/趨化因子相關(guān)基因處于網(wǎng)絡(luò)中心位置，說明在齲壞牙髓防御中占有重要地位。在篩選得到的中心蛋白中，基質(zhì) 金 屬蛋 白 酶 9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）是基質(zhì)金屬蛋白酶家族（MMPs）中的一員，亦是基質(zhì)重建的調(diào)控因子之一，參與了細(xì)胞外基質(zhì)局部的蛋白水解和白細(xì)胞遷移，同時(shí)與破骨細(xì)胞吸收有關(guān)[7]。MMPs家族是已知重要的生物活性劑和生長(zhǎng)因子，被證實(shí)參與了病理過程中細(xì)胞外基質(zhì)的崩解，并在修復(fù)性牙本質(zhì)形成過程中有調(diào)節(jié)牙本質(zhì)分解產(chǎn)物的潛能[8]。CD44是透明質(zhì)酸受體，介導(dǎo)細(xì)胞間和細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用，同時(shí)與MMPs家族蛋白、骨橋蛋白和膠原蛋白的關(guān)系密切，在細(xì)胞遷移、淋巴細(xì)胞募集歸巢和血細(xì)胞生成等活動(dòng)中起重要作用[9]。CTSS（ca?thepsinS）是一種溶酶體半胱氨酸蛋白酶，在2型組織相容復(fù)合體分子（MHCⅡ）的遞呈中，將抗原蛋白降解成多肽[10]。而牙髓樹突狀細(xì)胞可表達(dá)MHCⅡ分子，當(dāng)牙本質(zhì)遭到齲壞侵襲時(shí)，未成熟的抗原提呈樹突狀細(xì)胞會(huì)通過遷移來捕獲外來抗原[11]。

IL-8（interleukin8，白細(xì)胞介素 8；或 C-X-C motifchemokineligand8，C-X-C基序趨化因子配體 8）、CXCL12、CXCL1、CXCR4（C-X-Cmotifche?mokinereceptor，C-X-C基序趨化因子受體4）同屬趨化因子家族，廣泛存在于血管、肝臟、神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉等多種組織和細(xì)胞中。不但參與正常組織的形成，也介導(dǎo)炎癥的發(fā)生發(fā)展和損傷修復(fù)反應(yīng)[12]。IL-8已成為衡量牙髓炎癥的一個(gè)重要指標(biāo)，研究證實(shí)人牙髓細(xì)胞（humandentalpulp cells，hDPCs）在炎癥條件下會(huì)高表達(dá) IL-8，牙髓干細(xì)胞受到脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）刺激后會(huì)產(chǎn)生IL-8等大量促炎因子[13]。而趨化因子在清除感染的同時(shí)，也與生長(zhǎng)因子協(xié)同作用促進(jìn)組織的修復(fù)過程。MTA（mineraltrioxideaggre?gate，無機(jī)三氧化聚合物）蓋髓實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，組織修復(fù)過程中細(xì)胞釋放的IL-1α、-1β、-2、-6、-8明顯增加[14]。CXCR4是目前所知的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（stromalcell-derivedfactor-1，SDF-1）的惟一受體，二者構(gòu)成SDF-1/CXCR4軸，其介導(dǎo)成體干細(xì)胞定向遷移歸巢和在血管新生和組織再生修復(fù)中的作用已受到廣泛關(guān)注，并擴(kuò)展到牙髓再生治療的研究中[15]。而在大鼠牙本質(zhì)-牙髓損傷修復(fù)模型中觀察發(fā)現(xiàn)SDF-1α、CXCR4的表達(dá)呈現(xiàn)時(shí)間和程度相關(guān)性，提示二者可能參與誘導(dǎo)了修復(fù)性牙本質(zhì)的形成[16]。

本實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果的多樣性也反映了齲病發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜性，覆蓋了多種生理病理反應(yīng)，其牽涉基因、蛋白種類之多，也印證了齲病控制之困難。其在齲病病因和牙髓修復(fù)再生研究中的預(yù)測(cè)價(jià)值，除炎癥因子等少部分基因已在歷年研究中獲得證實(shí)或得到部分驗(yàn)證，多數(shù)差異基因還須通過大量臨床病例驗(yàn)證和體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。此外，鑒于齲病的多樣性和研究工具的不斷發(fā)展，將來仍然需要涉及不同地區(qū)、人群，不同研究平臺(tái)的大量的樣本來不斷充實(shí)和驗(yàn)證我們的結(jié)果。