方盛華 柳子川 鄧旭斌

廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院1內(nèi)一科，2內(nèi)二科（廣州510095）

口腔癌是發(fā)生在口腔的惡性腫瘤的總稱，它是頭頸部較常見的惡性腫瘤之一［1］。口腔癌主要起源于口腔上皮細胞的惡性病變，約80%屬于鱗狀上皮細胞癌［2］。口腔癌發(fā)病隱蔽，早期缺乏特異性的臨床表現(xiàn)。大部分患者確診口腔癌時，多為疾病的中晚期狀態(tài)。因此，發(fā)掘可早期診斷口腔癌的分子標記物，并發(fā)現(xiàn)口腔癌新的治療靶標，為臨床亟待解決的問題。癌基因的激活通常導致口腔癌的發(fā)生、進展以及遠處轉(zhuǎn)移。針對癌基因的特異性治療，可能為口腔癌的治療開發(fā)新靶點打下初步的理論基礎［3］。

HOXA3是近來發(fā)現(xiàn)的一個促癌基因。研究發(fā)現(xiàn)：HOXA3可以促進細胞生長，以及腫瘤細胞的侵襲以及轉(zhuǎn)移［4］。關(guān)于HOXA3在腫瘤中的研究目前較少，在口腔癌中尚未見相關(guān)報道。本研究擬探討HOXA3在口腔癌中的表達情況，并敲除HOXA3表達，在細胞功能以及機制上研究HOXA3對口腔癌細胞生長及侵襲能力的影響。

本研究明確HOXA3基因在口腔癌中的表達情況，以及致病作用，為口腔癌的治療開發(fā)新靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 口腔癌細胞購自上海中科院。細胞使用PRMI?1640（含10%胎牛血清），放置于含5%CO2的37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 實時熒光定量PCR（qRT?PCR），蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）試驗 使用TRIzol試劑（Invitrogen公司）提取口腔癌細胞RNA。實時熒光定量PCR的試劑盒（qSYBR?green?containing PCR kit）購自Takara。

使用Lysis buffer提取細胞蛋白質(zhì)，95℃水浴鍋使蛋白質(zhì)變性。使用蛋白質(zhì)印跡法檢測相關(guān)蛋白在細胞中的表達水平。cyclinD1，c?myc，CDK4以及GAPDH抗體購自santa cruz公司。MMP?1、MMP?2、MMP?9購自abcam公司。二抗購自中杉金橋。ECL顯色發(fā)光試劑盒購自康維世紀。

1.3 細胞凋亡試驗 檢測細胞凋亡試劑盒（FITC?PI雙染色）購自碧云天公司。細胞染色后，使用流式細胞儀檢測相關(guān)凋亡情況。

1.4 構(gòu)建低表達HOXA3基因的口腔癌細胞 根據(jù)HOXA3基因序列，設計合成已證實能穩(wěn)定沉默HOXA3基因的片段（sh?HOXA3）。將sh?HOXA3基因片段構(gòu)建到慢病毒載體（pLK0.1）中。包裝慢病毒，使用慢病毒上清感染scc?9細胞。根據(jù)綠色熒光蛋白（GFP）篩選出穩(wěn)定感染的細胞。Western blot驗證敲除HOXA3效率。

1.5 Boyden以及劃痕實驗 Boyden實驗步驟：消化好口腔癌細胞SCC?9，用不含血清的培養(yǎng)基重懸，置于boyden小室，小室放在12孔板。小室外使用含10%血清的培養(yǎng)基做誘導劑。24 h后，取出小室，計算穿透小室膜的細胞數(shù)目。

劃痕實驗步驟：細胞長至完全匯合后，使用無菌槍頭在培養(yǎng)皿中央劃痕。24 h后，觀察不同處理組之間細胞愈合的差異。

1.6 裸鼠皮下成瘤實驗 將裸鼠隨機分成4組，每組5只。將1×106個細胞接種于裸鼠皮下，接種后5天，按以下方式處理：第1組為空白對照組（sh?ctrl），第 2組為敲除 HOXA3組（sh?HOXA3）。腫瘤體積每3天監(jiān)測1次。腫瘤體積使用V=π/6（高度×長度×寬度）公式計算。

1.7 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。兩組之間數(shù)據(jù)的差異使用兩樣本t檢驗。多組別之間的差異使用方差分析。P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HOXA3在口腔癌組織中表達水平上調(diào) 首先，筆者使用GEO數(shù)據(jù)庫中的芯片（編號：GSE74530）分析口腔癌組織以及癌旁組織中表達差異的基因。從表達差異最明顯的10個分子中（圖1），筆者挑選HOXA3做進一步研究。分析結(jié)果提示：與癌旁組織相比，口腔癌組織中HOXA3表達上調(diào)（圖1A）。筆者接著使用RT?PCR分析HOXA3在27列口腔癌及癌旁組織中表達水平的差異。結(jié)果與GSE74530芯片結(jié)果類似，口腔癌組織中HOXA3表達水平較癌旁組織顯著上調(diào)（圖1B）。Western blot以及免疫組化結(jié)果也進一步驗證，HOXA3蛋白在口腔癌組織中較癌旁組織中表達上調(diào)（圖1C，D）。

圖1 HOXA3在口腔癌組織中表達水平Fig.1 Expression of HOXA3 in oral cancer tissue

2.2 敲除HOXA3后可以抑制口腔癌細胞生長及促進凋亡 前面的研究發(fā)現(xiàn)HOXA3在口腔癌組織中表達顯著上升，提示HOXA3可能是潛在的癌基因。因此，我們使用慢病毒干擾片段下調(diào)口腔癌細胞株中HOXA3的表達，研究口腔癌細胞生長及侵襲能力的變化情況。

筆者挑選SCC?9口腔癌細胞株做功能相關(guān)實驗。首先，我們使用慢病毒感染SCC?9細胞，建立低表達HOXA3蛋白的細胞株（圖2A）。平板克隆試驗發(fā)現(xiàn)：敲除HOXA3蛋白后，SCC?9細胞形成克隆的數(shù)目和大小較空白對照組明顯減弱（圖2B）。MTT試驗發(fā)現(xiàn)：敲除HOXA3蛋白后，細胞生長的速度明顯減慢（圖2C）。Western blot實驗提示：敲除HOXA3蛋白后，調(diào)控細胞增殖的蛋白（cyclind1，CDK4，CDK6）表達水平也下調(diào)（圖2D）。凋亡試驗發(fā)現(xiàn)：敲除HOXA3蛋白后，可以促進SCC?9細胞的凋亡（圖2E）。

圖2 敲除HOXA3后口腔癌細胞生長及凋亡情況Fig.2 Growth and apoptosis of oral cancer cells after HOXA3 knockout

2.3 敲除HOXA3后可以抑制口腔癌細胞侵襲能力 筆者接著研究HOXA3對口腔癌細胞侵襲能力的影響。Transwell實驗提示：敲除HOXA3之后，細胞遷徙能力下降（圖3A）。劃痕實驗也與Transwell結(jié)果一致，提示下調(diào)HOXA3表達可抑制口腔癌細胞遷徙能力（圖3B）。Western blot實驗提示：敲除HOXA3蛋白后，調(diào)控細胞侵襲的蛋白（MMP1，MMP2，MMP9）表達水平也下調(diào)（圖3C）。

圖3 敲除HOXA3對口腔癌細胞侵襲能力的影響Fig.3 Effect of knockout HOXA3 on invasive ability of oral cancer cells

2.4 HOXA3對裸鼠成瘤能力的影響 最后筆者探討HOXA3是否影響裸鼠體內(nèi)成瘤能力。研究發(fā)現(xiàn)，敲除HOXA3之后，SCC?9細胞在裸鼠體內(nèi)生長速度明顯減弱（圖4A），其成瘤大小及重量也明顯小于空白對照組（圖4B）。這些實驗表明：下調(diào)HOXA3之后，可減弱口腔癌細胞的體內(nèi)成瘤能力。

3 討論

口腔癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，約占全身惡性腫瘤的3%［5］?？谇话?年生存率約為55%～60%，為危害人類健康的常見腫瘤之一［5］。在我國，口腔癌的發(fā)病率近期有上升的趨勢。

圖4 HOXA3對裸鼠成瘤能力的影響Fig.4 The effect of HOXA3 on the tumorigenicity of nude mice

口腔癌的發(fā)生及進展是多因素、多步驟、多階段的復雜過程，其中，基因表達的異常為口腔癌發(fā)病的重要原因［6］。癌基因的激活及過度表達為口腔癌病變的分子機制之一［7］。在基因水平明確口腔癌的發(fā)病機制，對口腔癌的早期診斷，個體治療及開發(fā)新治療靶點具有重要意義。

HOXA3是同源異型盒基因（homeobox genes，HOX）家族成員之一。HOX基因是一類在進化上高度保守的基因，可調(diào)控機體的正常發(fā)育。但是，HOX基因異常表達通常導致了惡性腫瘤的發(fā)生及進展［8］。例如：HOXA基因與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生相關(guān)。HOXA10在低分化子宮內(nèi)膜癌中高表達，其表達水平升高預示預后不良［9］。HOXA1可作為乳腺癌主要的致癌因子，其可促進乳腺癌對化療藥物阿霉素的抵抗［10］。在消化系統(tǒng)腫瘤中，HOX家族基因可促進結(jié)腸癌的發(fā)病以及遠處轉(zhuǎn)移［4］。這些研究結(jié)果表明：HOX家族基因的異常表達可作為促癌因素，導致腫瘤的發(fā)生及遠處轉(zhuǎn)移。

本研究首先通過分析GEO芯片，發(fā)現(xiàn)在口腔癌組織中，HOXA3表達水平較癌旁組織升高。進一步采用RT?PCR分析臨床口腔癌組織樣本，初步證實了GEO芯片結(jié)果。我們還使用western blot檢測了口腔癌組織樣本中HOXA3的含量，結(jié)果與RT?PCR一致。免疫組化也發(fā)現(xiàn)HOXA3在口腔癌組織中表達上調(diào)。這些結(jié)果提示HOXA3可能作為促進口腔癌進展的一個癌基因。

在后續(xù)的功能實驗當中，筆者首先降低了SCC?9口腔癌細胞株中HOXA3的表達。平板克隆、MTT等試驗提示：降低了HOXA3表達水平之后，口腔癌SCC?9細胞的生長能力下降，并且發(fā)生了凋亡。敲除HOXA3之后，促進細胞生長的cyclinD1，CDK4，c?myc等蛋白分子也表達下調(diào)。這些結(jié)果表明：HOXA3可以促進口腔癌細胞的增殖。Boyden及劃痕試驗提示敲除HOXA3之后，還減弱了口腔癌細胞的侵襲能力。MMP?1，MMP?2，MMP?9為可促進腫瘤細胞侵襲及遠處轉(zhuǎn)移的重要分子。我們發(fā)現(xiàn)敲除HOXA3之后，可以降低MMP?1，MMP?2以及MMP?9的表達。這些結(jié)果提示HOXA3可以促進口腔癌細胞的侵襲。本研究首先發(fā)現(xiàn)HOXA3是口腔癌發(fā)病的重要癌基因，它可以通過促進口腔癌細胞生長，以及增殖發(fā)揮其相關(guān)作用。當然，本研究也存在不足之處：在機制上的研究尚不充分，HOXA3是通過哪個相關(guān)信號通路發(fā)揮其生物學作用，在本研究中尚未充分闡明。在后續(xù)的研究中，我們將繼續(xù)探討HOXA3的分子作用機制。

綜上所述，HOXA3可作為促進口腔癌增殖及侵襲的重要因子。針對HOXA3這個靶點可能為口腔癌的治療提供新的思路以及治療方式。

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