王瑾 張梅君 李云峰 廖立凡湖北省第三人民醫(yī)院口腔科（武漢430030）；西安交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院、陜西省顱頜面精準醫(yī)學(xué)研究重點實驗室（西安70004）

舌鱗狀細胞癌是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤之一，常伴有早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，惡性程度高［1］?；蛩降闹委熞殉蔀樯圜[狀細胞癌研究的重要方向［2］。微小RNA（miRNA）是一類長度約為20～25個核苷酸的小分子非編碼RNA，可引起下游基因mRNA的降解或抑制其翻譯，調(diào)控細胞增殖、凋亡、衰老等生物學(xué)行為［3-4］。miR?758?3p是近年來新發(fā)現(xiàn)的miRNA，對miR?758?3p的研究報道較少。已有研究證實，miR?758?3p可在肝癌和宮頸癌中發(fā)揮腫瘤抑制作用［5-6］。本研究擬通過轉(zhuǎn)染miR?758?3p至舌鱗狀細胞癌細胞株，探討miR?758?3p在舌鱗狀細胞癌中的作用機制及對腫瘤細胞增殖和遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM?F12、高糖DMEM、DK?SFM和胎牛血清（FBS）購于美國Gibco公司。人舌鱗狀細胞癌細胞株CAL27、HNl3、SCC15、TSCCA和人正常口腔黏膜細胞HOK購于中國科學(xué)院上海細胞生物所。Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000試劑盒購于美國Invitrogen公司。引物購于南京金斯瑞公司。miR?758?3p 模擬物、miR?NC）、TRIM44野生型質(zhì)粒（TRIM44?WT）和 TRIM44突變型質(zhì)粒（TRIM44?MT）購于上海漢恒生物科技有限公司。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于美國Pro?mega公司。一抗均購于美國BD公司。MTT試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)研究所。Transwell小室購于美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 CAL27細胞培養(yǎng)在10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，HNl3和TSCCA細胞培養(yǎng)在10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，SCC15細胞培養(yǎng)在10%FBS的DMEM?F12培養(yǎng)基，HOK細胞培養(yǎng)在DK?SFM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱。取生長狀態(tài)良好的TSCCA細胞接種到6孔板中，待細胞融合度達到60%～70%時，按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書，將miR?NC（對照組）或miR?758?3p（實驗組）分別轉(zhuǎn)染至TSCCA細胞。

1.2.2 RNA提取和qPCR檢測 收集細胞，使用Trizol?氯仿-異丙醇法提取細胞總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將2 μg總RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，PCR擴增檢測得到循環(huán)閾值（Ct），采用 2?ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)。以U6為內(nèi)參檢測miR?758?3p的表達，以GAPDH為內(nèi)參檢測TRIM44 mRNA的表達。

1.2.3 生物信息學(xué)預(yù)測及雙熒光素酶報告基因驗證 microRNA.org軟件預(yù)測顯示，miR?758?3p與TRIM44之間存在較好的堿基互補配對關(guān)系，見圖1。將對數(shù)期的TSCCA細胞接種于6孔板，待細胞融合度為60%～70%，分別進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，嚴格根據(jù)雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書進行操作，檢測各組熒光素酶活性。

1.2.4 Western blot檢測TRIM44蛋白的相對表達量 收集各組細胞，裂解液裂解細胞收集蛋白，通過SDS?PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，封閉后加入一抗4°C下孵育過夜，室溫下二抗孵育1 h，增強型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）發(fā)光液顯影。

表1 qPCR引物序列Tab.1 qPCR primer sequences

圖1 miR?758?3p與TRIM44 3′?UTR互補配對的序列Fig.1 Sequence of miR?758?3p complementary binding to TRIM44 3′?UTR

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布 收集各組細胞，預(yù)冷的70%乙醇溶液重懸固定過夜，100 mg/L RNase A重懸，在37°C水浴孵育15 min，加入含50 mg/L碘化丙啶溶液的PBS緩沖液500 μL，4℃避光孵育15 min，流式細胞儀檢測各組的細胞周期分布。

1.2.6 MTT法檢測細胞增殖能力 收集各組細胞，以5×103個/孔接種于96孔板中，每組設(shè)4個復(fù)孔。于1、2、3、4和5 d時分別取各時段的細胞，每孔加入20 μL MTT溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，離心棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），酶標儀檢測每孔光密度OD值。

1.2.7 Transwell法檢測細胞遷移能力 收集各組細胞，以2×104/孔接種于Transwell上室，下室加入600 μL含血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。棉簽擦去上室內(nèi)未穿過孔膜的細胞，使用1 mL 4%多聚甲醛固定10 min，使用1 mL 0.1%結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡下觀察計數(shù)穿膜細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行組間數(shù)據(jù)比較分析，計量資料用均值±標準差表示，兩組獨立樣本均數(shù)比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人舌鱗狀細胞癌細胞株中miR?758?3p的表達 qPCR結(jié)果顯示，人舌鱗狀細胞癌細胞株CAL27、HNl3、SCC15、TSCCA和人正?？谇火つぜ毎鸋OK細胞中miR?758?3p的相對表達量分別為：0.51±0.06、0.64±0.11、0.57±0.09、0.28±0.13和1.00 ± 0.09，miR?758?3p在舌鱗狀細胞癌細胞中的表達水平明顯低于其在正常口腔黏膜細胞中的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。TSCCA細胞中miR?758?3p表達水平最低，故以TSCCA細胞為后續(xù)研究模型。

2.2 qPCR檢測轉(zhuǎn)染后細胞中miR?758?3p和TRIM44 mRNA的表達 qPCR結(jié)果顯示，實驗組和對照組TSCCA細胞中miR?758?3p的相對表達量分別為63.89±11.24和1.09±0.47（P＜0.01）。實驗組TSCCA細胞中TRIM44 mRNA的相對表達量明顯低于對照組（P＜0.05）。

2.3 miR?758?3p與TRIM44的靶向關(guān)系 構(gòu)建野生型和突變型的TRIM44真核表達載體。雙熒光素酶報告基因檢測顯示共轉(zhuǎn)染miR?758?3p+TRIM44?WT的TSCCA細胞熒光活性顯著下降（P＜ 0.01，圖2）。

圖2 各組TSCCA細胞中熒光素酶活性的比較Fig.2 Comparison of luciferase activity in TSCCA cells of two groups

2.4 過表達miR?758?3p下調(diào)TSCCA細胞中TRIM44蛋白表達 Western blot檢測結(jié)果顯示，實驗組TSCCA細胞中TRIM44蛋白的表達量明顯低于對照組，mTOR磷酸化水平降低，細胞周期相關(guān)蛋白CDK4和Cyclin D1蛋白表達降低，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的上皮表型β?catenin蛋白表達升高，間質(zhì)表型Vimentin蛋白表達降低（圖3）。

2.5 過表達miR?758?3p抑制TSCCA細胞周期進展 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR?758?3p后，TSCCA細胞在G0/G1期的細胞比例明顯升高（P＜ 0.01），表明miR?758?3p可抑制TSCCA細胞周期進展。

2.6 過表達miR?758?3p抑制TSCCA細胞的增殖活性 MTT檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR?758?3p后，TSCCA細胞由第4天開始，增殖活性顯著低于對照組（P＜0.01，圖4）。

圖3 miR?758?3p對TSCCA細胞中TRIM44蛋白及下游蛋白表達的影響Fig.3 Effect of miR?758?3p on the expression of TRIM44 protein and downstream proteins in TSCCA Cells

Fig.4 The proliferative activity of TSCCA cells in two groups was detected by MTT圖4 MTT檢測兩組TSCCA細胞的增殖活性

2.7 過表達miR?758?3p對TSCCA細胞的遷移能力的影響 Transwell遷移實驗結(jié)果顯示：實驗組TSCCA細胞的穿膜細胞數(shù)［（34.11±7.33）個］明顯低于對照組組［（71.56±14.26）個］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01），表明過表達miR?758?3p可抑制TSCCA細胞的遷移能力。

3 討論

基因靶向治療是近年來舌鱗狀細胞癌防治研究的熱點［7］。miRNA通過在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)相關(guān)下游的基因表達，影響腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，具有癌基因和抑癌基因的作用［8-10］。有研究［5］顯示，miR?758?3p在肝癌組織及其細胞株內(nèi)表達均降低，轉(zhuǎn)染miR?758?3p后可顯著抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。miR?758?3p在其他腫瘤如舌鱗狀細胞癌的功能及作用機制尚不清楚。

本研究中，qPCR結(jié)果顯示miR?758?3p在舌鱗狀細胞癌細胞株中的表達明顯下調(diào)，表明miR?758?3p可能參與舌鱗狀細胞癌細胞的發(fā)生、發(fā)展。通過microRNA.org軟件預(yù)測及雙熒光素酶報告基因驗證miR?758?3p的下游基因是三結(jié)構(gòu)域蛋白44（TRIM44）。TRIM44是三結(jié)構(gòu)域蛋白（TRIM）家族成員之一，是細胞生物學(xué)功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在腫瘤的形成和進展中發(fā)揮重要作用［11］。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路是細胞增殖、遷移和侵襲等多種細胞功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［12］。TRIM44能通過mTOR信號通路促進腫瘤的轉(zhuǎn)移和增殖［13］。Western blot結(jié)果顯示，miR?758?3p 下調(diào)TRIM44蛋白表達后，TSCCA細胞中mTOR的磷酸化水平明顯降低，細胞周期相關(guān)蛋白CDK6和Cyclin D1蛋白表達下降，上皮細胞表型β?catenin蛋白表達升高，間質(zhì)細胞表型Vimentin蛋白表達下降。過表達miR?758?3p可明顯抑制舌鱗狀細胞癌細胞株細胞周期的進展，降低細胞增殖能力，抑制細胞的遷移能力。

本研究結(jié)果顯示，miR?758?3p在舌鱗狀細胞癌細胞株中低水平表達，可通過抑制TRIM44基因的表達，干擾mTOR信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制舌鱗狀細胞癌細胞的增殖和遷移。miR?758?3p可能為舌鱗狀細胞癌的分子治療提供了新的靶點。

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