盧洪勝 曹學(xué)全 包衛(wèi)光 章輝 周璐青 於櫻枝

胃癌是全球發(fā)病率第5位的惡性腫瘤，在腫瘤死亡率中居第3位[1]。由于晚期胃癌患者復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高，且缺乏有效的治療策略，因此預(yù)后較差[2]。此外，胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機制仍不清楚。因此，識別新的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因和闡述其潛在的機制可能為抗癌治療提供潛在的靶點。MYBL2基因，也被稱為B-myb，是MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，在所有增殖細(xì)胞中廣泛表達(dá)[3]。MYBL2在細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞存活和細(xì)胞分化過程中起作用，提示MYBL2失調(diào)可能具有致癌潛能。MYBL2在乳腺癌、大腸癌和食管癌等多種實體癌中過表達(dá)，且與患者預(yù)后不良有關(guān)[4-6]。研究證實，MYBL2在p53基因突變的腫瘤中不成比例的上調(diào)，甚至在p53突變的細(xì)胞中可以克服DNA損傷誘導(dǎo)G2期阻滯[7]。目前胃癌組織中MYBL2和p53蛋白聯(lián)合表達(dá)的臨床意義研究鮮見報道。本研究采用組織芯片結(jié)合免疫組化En Vision法檢測88例胃癌和相應(yīng)癌旁組織中MYBL2和p53蛋白的表達(dá)差異，分析MYBL2和p53表達(dá)與胃癌臨床病理因素的關(guān)系，以及胃癌組織中MYBL2和p53蛋白表達(dá)的相關(guān)性，初步探討MYBL2和p53蛋白異常表達(dá)在胃癌發(fā)生、進(jìn)展中的臨床意義及兩者之間的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集我院2013年1月至2017年7月間行根治手術(shù)的88例胃癌切除標(biāo)本，均具有完整的臨床病理資料，患者術(shù)前均未接受放射和化學(xué)治療，術(shù)后均經(jīng)病理證實。腫瘤組織均取自腫瘤中心非壞死部分，同時取距離腫瘤＞5cm相應(yīng)的癌旁正常黏膜組織作為對照。88例胃癌患者中男58例，女30例，年齡32~78（66.26±12.35）歲。組織學(xué)分級：高分化9例，中分化30例，低分化49例。根據(jù)2016年國際抗癌聯(lián)盟第8版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：I期10例，Ⅱ期25例，Ⅲ52例，Ⅳ期1例。浸潤深度（T分期）：T19例，T212例，T32例，T465例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況（N分期）：N019例，N114例，N221例，N334例。所有組織標(biāo)本取出后迅速用10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋。

1.2 主要試劑 鼠抗人MYBL2單克隆抗體購自美國Abnova公司，鼠抗人p53單克隆抗體購自美國Sigma公司，即用型羊抗鼠免疫組化En VisionTM檢測試劑盒和DAB顯色劑均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3 組織芯片的制作 對所有供體組織蠟塊行常規(guī)病理切片后HE染色，由2位病理科副主任醫(yī)師進(jìn)行診斷，并在顯微鏡下找到典型病變部位作標(biāo)記。利用組織芯片制作儀在受體蠟塊上打直徑1mm的孔，根據(jù)HE切片上標(biāo)記的病變部位，然后在供體組織蠟塊上的對應(yīng)位置獲取同樣大小直徑的組織芯，插入受體蠟塊陣列孔中，并記錄組織編號，重復(fù)上述步驟制成陣列塊，以4~5μm厚度連續(xù)切片，分別進(jìn)行HE及免疫組化染色。所得組織芯片的每個點均經(jīng)過病理診斷。

1.4 免疫組化染色 采用En Vision二步法進(jìn)行免疫組化染色，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，0.1mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液高溫高壓抗原修復(fù)，3%BSA封閉，一抗（MYBL2 工作濃度 1：200；p53 工作濃度 1：100）4℃過夜，DAB顯色，封片后光鏡下觀察。以PBS液代替一抗做陰性對照。

1.5 結(jié)果判定 免疫組化染色出現(xiàn)淡黃色至棕黃色顆粒為陽性。MYBL2陽性表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，p53定位于細(xì)胞核。隨機選取5個以上高倍視野（×400），每個高倍視野計數(shù)不少于200個細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核出現(xiàn)陽性信號的細(xì)胞數(shù)＞10%為陽性，＜10%為陰性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。不同組織間MYBL2和p53表達(dá)差異采用χ2檢驗，采用Spearman等級相關(guān)對胃癌組織中MYBL2和p53的表達(dá)行相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MYBL2和p53在胃癌和癌旁組織中表達(dá)的比較MYBL2陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核出現(xiàn)黃色至棕黃色顆粒（圖1-2，見插頁），p53蛋白陽性表達(dá)為細(xì)胞核呈現(xiàn)黃色至棕黃色顆粒（圖3-4，見插頁）。MYBL2和p53在胃癌組織中陽性率分別為62.50%（55/88）、70.45%（62/88），癌旁組織中陽性表達(dá)率分別為12.50%（11/88）、10.22%（9/88），胃癌組織中MYBL2和p53表達(dá)明顯高于癌旁組織（均P＜0.05）。見表1。

表1 MYBL2和p53在胃癌和癌旁組織中的表達(dá)[例（%）]

2.2 MYBL2和p53表達(dá)與胃癌臨床病理因素的關(guān)系隨著胃癌患者臨床分期增加、浸潤深度加深及淋巴結(jié)發(fā)生癌轉(zhuǎn)移，胃癌組織中MYBL2和p53表達(dá)進(jìn)一步升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），而在患者不同年齡、性別、腫瘤大小及分化程度間的表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。見表2。

2.3 胃癌組織中MYBL2表達(dá)和p53表達(dá)的相關(guān)性88例胃癌組織中MYBL2表達(dá)陽性和p53表達(dá)陽性者51例，MYBL2表達(dá)陰性和p53表達(dá)陰性者 22例，胃癌組織中MYBL2表達(dá)和p53表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.630，P=0.000）。見表 3。

3 討論

MYBL2位于染色體20q13，是Myb轉(zhuǎn)錄因子家族的高度保守成員，并且在增殖細(xì)胞中普遍表達(dá)，特別是在胚胎干細(xì)胞和成人造血前體[8]。在生理情況下，MYBL2調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞存活和細(xì)胞分化，然而在惡性腫瘤中常常發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，能夠顯著促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展[9]。Liang等[10]報道，膽囊癌組織中MYBL2表達(dá)增加，且與膽囊癌患者的組織學(xué)分級，腫瘤浸潤深度，臨床分期和不良總生存率有關(guān)。體外實驗顯示，MYBL2表達(dá)的下調(diào)可抑制膽囊癌細(xì)胞增殖和DNA復(fù)制以及裸鼠異種移植腫瘤的生長。相反，MYBL2過表達(dá)導(dǎo)致相反的效果。Tao等[11]發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中，敲除MYBL2表達(dá)能夠恢復(fù)上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白的表達(dá)和細(xì)胞-細(xì)胞間的鏈接，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲、獨立性生長和腫瘤的形成。p53基因位于染色體17pl3，分為野生型和突變型兩種，編碼產(chǎn)物含有393個氨基酸的p53蛋白。野生型p53通過激活和下調(diào)基因表達(dá)而主要作為轉(zhuǎn)錄因子起作用，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯或細(xì)胞凋亡，是一種抑癌基因[12]。突變型p53基因的擴增具有促癌作用，可與野生型p53基因結(jié)合抑制其表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞過度增殖、凋亡細(xì)胞明顯減少，最終引起惡性腫瘤的發(fā)生[13]。

表2 MYBL2和p53表達(dá)與胃癌臨床病理因素的關(guān)系[例（%）]

表3 MYBL2和p53在胃癌組織中表達(dá)的相關(guān)性

本實驗結(jié)果表明，胃癌組織中MYBL2和p53蛋白陽性表達(dá)率分別為62.50%、70.45%，癌旁組織中分別為12.50%、10.22%，胃癌組織中MYBL2和p53的表達(dá)均明顯高于癌旁組織（P＜0.05）。表明MYBL2和p53表達(dá)升高可能與胃黏膜上皮癌變的發(fā)生有關(guān)，與Yu等[14]在胰腺導(dǎo)管腺癌中的文獻(xiàn)報道一致。結(jié)合胃癌患者臨床病理資料進(jìn)行分析，MYBL2和p53表達(dá)與胃癌臨床病理因素關(guān)系的結(jié)果顯示，隨著胃癌患者臨床分期進(jìn)展、浸潤深度加深及淋巴結(jié)發(fā)生癌轉(zhuǎn)移，MYBL2和p53陽性表達(dá)率進(jìn)一步升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示MYBL2和p53表達(dá)與胃癌的臨床分期、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，胃癌組織中MYBL2和p53表達(dá)共陽性者51例，表達(dá)共陰性者22例，胃癌組織中MYBL2和p53陽性表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）。有研究顯示，p53-p21-DREAM途徑抑制MYBL2表達(dá)，特別是在細(xì)胞應(yīng)激的條件下，如DNA損傷。然而在p53基因突變的腫瘤中調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞存活的MYBL2基因異常[15]。表明MYBL2和突變型p53是一對協(xié)同作用因素，可能通過某種調(diào)節(jié)機制參與胃癌的發(fā)生、進(jìn)展過程。

綜上所述，與癌旁組織比較，胃癌組織中MYBL2和p53蛋白存在過表達(dá)，其異常表達(dá)與胃癌患者的臨床分期、浸潤深度及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，胃癌組織中MYBL2和p53陽性表達(dá)呈正相關(guān)。聯(lián)合檢測MYBL2和p53有助于評估胃癌的生物學(xué)行為和預(yù)后，為胃癌的靶向治療和進(jìn)一步研究其浸潤、轉(zhuǎn)移的分子機制提供理論基礎(chǔ)。

圖1 MYBL2表達(dá)的組織芯片位點圖（En Vision法，×50）

圖2 MYBL2在胃癌組織中陽性表達(dá)（En Vision法，×400）

圖3 p53表達(dá)的組織芯片位點圖（En Vision法，×50）

圖4 p53在胃癌組織中陽性表達(dá)（En Vision法，×400）

4 參考文獻(xiàn)

[1]Ferlay J,Soerjomataram I,Dikshit R,et al.Cancer incidence and mortality worldwide：Sources,methodsand major patternsin GLOBOCAN 2012[J].Int J Cancer,2015,136(5)：E359-386.

[2]Fock KM.Review article：the epidemiology and prevention of gastric cancer[J].Aliment PharmacolTher,2014,40(3)：250-260.

[3]Martinez I,Dimaio D.B-Myb,cancer,senescence,and microRNAs[J].Cancer Res,2011,71(16)：5370-5373.

[4]Inoue K,Fry EA.Novel molecular markers for breast cancer[J].Biomark Cancer,2016,8：25-42.

[5]Ren F,Wang L,Shen X,et al.MYBL2 is an independent prognostic marker that has tumor-promoting functions in colorectal cancer[J].Am J Cancer Res,2015,5(4)：1542-1552.

[6]Qin HD,Liao XY,Chen YB,et al.Genomic characterization of esophageal squamous cell carcinoma reveals critical genes underlying tumorigenesis and poor prognosis[J].Am J Hum Genet,2016,98(4)：709-727.

[7]Parikh N,Hilsenbeck S,Creighton CJ,et al.Effects of TP53 mutational status on gene expression patterns across 10 human cancer types[J].J Pathol,2014,232(5)：522-533.

[8]Tarasov KV,Tarasova YS,Tam WL,et al.B-MYB is essential for normal cell cyle progression and chromosomal stability of embryonic stem cells[J].PLoS One,2008,3(6)：e2478.

[9]Musa J,Aynaud MM,Mirabeau O,et al.MYBL2(B-Myb)：a central regulator of cell proliferation,cell survival and differentiation invovled in tumorigenesis[J].CellDeath Dis,2017,8(6)：e2895.

[10]Liang HB,Cao Y,Ma Q,et al.MYBL2 is a Potential Prognostic Marker that promotes cell proliferation in gallbladder cancer[J].CellPhysiolBiochem,2017,41(5)：2117-2131.

[11]Tao D,Pan Y,Jiang G,et al.B-Myb regulates snail expression to promote epithelial-to-mesenchymal transition and invasion of breast cancer cell[J].Med Oncol,2015,32(1)：412.

[12]Martin Fischer,Marianne Quaas,Lydia Steiner,et al.The p53-p21-DREAM-CDE/CHR pathway regulates G2/M cell cycle genes.Nucleic Acids Res,2016 J,44(1)：164-174.

[13]Urata YN,Takeshita F,Tanaka H,et al.Targeted Knockdown of the kinetochore protein D40／Knl-1 inhibits human cancer in a p53 status independent manner[J].SciRep,2015,5：13676.

[14]Yu R,Li C,Lin X,et al.Clinicopathologic features and prognostic implications of MYBL2 protein expression in pancreatic ductal adenocarcinoma[J].PatholRes Pract,2017,213(8)：964-968.

[15]Fischer M,Quaas M,Steiner L,et al.The p53-p21-DREAMCDE/CHRpathway regulates G2/M cell cycle genes[J].Nucleic Acids Res,2016,44(1)：164-174.