黎運(yùn)呈 曾芳 王秋景 鄭迪 楊喆娟

隨著人們生活水平的提高，非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）患者日益增多。NAFLD進(jìn)一步發(fā)展，約15%患者發(fā)展至肝硬化，3%進(jìn)展至最終的肝衰竭[1-3]。NAFLD是一類肝組織學(xué)改變與酒精性肝病相類似，但無(wú)過量飲酒史的臨床病理綜合征[4]。NAFLD在臨床上以肝功能異常為主要表現(xiàn)，肝細(xì)胞的病理?yè)p傷尤以肝細(xì)胞線粒體損傷較為顯著。線粒體是肝細(xì)胞重要的細(xì)胞器之一，同時(shí)也是具有完整結(jié)構(gòu)和生化功能復(fù)雜、多變的細(xì)胞器，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外環(huán)境的變化可導(dǎo)致線粒體的結(jié)構(gòu)和功能異常，而肝線粒體的病變與細(xì)胞凋亡的發(fā)生密切相關(guān)[5-6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，山楂葉總黃酮（hawthorn leaves flavonoids，HLF）具有降血脂、抗氧化、降糖、抗血小板聚集等作用[7-8]。筆者通過觀察HLF對(duì)NAFLD細(xì)胞凋亡的影響，旨在揭示NAFLD發(fā)病的分子機(jī)制，為中藥干預(yù)治療NAFLD提供理論依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 HLF（長(zhǎng)春三九生物制藥，批號(hào)：20140823）；人正常肝細(xì)胞L-02株，購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究所細(xì)胞庫(kù)；FBS購(gòu)自杭州四季青公司；油酸（OA）購(gòu)自天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；軟脂酸（PA）、油紅O、二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;達(dá)氏修正依氏培養(yǎng)基（DMEM）和小牛血清（FCS）購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；TG試劑盒、考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程公司。化學(xué)藥品與試劑：Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)BD公司；MTT購(gòu)于瑞士羅氏公司；SDS-PAGE試劑購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；PVDF膜購(gòu)于德國(guó) Millipore公司；Caspase-9、Bcl-2、Bax和 β-actin抗體購(gòu)于Cell Signaling Technology；羊抗兔和羊抗鼠二抗購(gòu)于美國(guó)Bethyl公司。Cytochrome C購(gòu)于美國(guó)Bio－Vision公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人正常肝L-02細(xì)胞用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、含5%CO2的溫箱中培養(yǎng)72h，細(xì)胞70%～80% 融合時(shí)，以0.25%胰酶/0.02%EDTA消化傳代，更換培養(yǎng)液。

1.2.2 NAFLD實(shí)驗(yàn)分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞1×105/ml種植到6孔板，并孵育24h后，實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組、低劑量組（HLF 100μg/ml）和高劑量組（HLF 400μg/ml），每組4瓶細(xì)胞。正常組用MEM培養(yǎng)液換液，而模型組、低劑量組和高劑量組，換液時(shí)換成含有1mmol/L，F(xiàn)FA 混合物（OA∶PA=2∶1） 的 10%FBS 的MEM培養(yǎng)液誘導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，每組4個(gè)培養(yǎng)瓶。誘導(dǎo)24、48、72h后收集細(xì)胞，分別進(jìn)行油紅O染色、顯微鏡觀察、計(jì)算細(xì)胞活力和TG測(cè)定等，確定細(xì)胞模型。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 不同劑量HLF作用L-02細(xì)胞共48h，顯微鏡下觀察正常組、模型組、低劑量組、高劑量組的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用Annexin V和PI雙染的方法檢測(cè)凋亡細(xì)胞。不同濃度HLF作用于L-02細(xì)胞48h后，用0.25%胰酶消化并收集細(xì)胞。1 500 r/min離心5 min，4℃，細(xì)胞用PBS洗2次，棄上清液，細(xì)胞在4℃下的稀釋結(jié)合液中重懸。取Annexin V-FITC溶液5 μl和PI 2.5 μl加到 100 μl細(xì)胞懸液中，混勻，避光，在冰水中孵育10 min。加稀釋的結(jié)合液400 μl到細(xì)胞懸液中混勻后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，于激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處測(cè)定細(xì)胞凋亡率，并采用CellQuest流式軟件分析。

1.2.5 凋亡蛋白表達(dá)檢測(cè) 不同濃度HLF作用于L-02細(xì)胞48h后，用0.25%胰酶消化收集細(xì)胞。Western blot法檢測(cè) Bcl-2、Bax、Caspase-9及 Cytochrome C 蛋白表達(dá)。采用 mitochondria/cytosol fractionation kit（Bio－Vision,Mountain View,CA）試劑盒說明書將線粒體及細(xì)胞溶質(zhì)分開。提取蛋白后采用12%SDS-PAGE膠分離蛋白條帶，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜。膜采用含5%脫脂牛奶的 TBST 液[10 mmol/L Tris-HCl（pH7.5），150 mmol/L氧化鈉和 0.05%Tween-20]封閉，分別采用Bcl-2（1：1 000），Bax（1：1 000），Caspase-9（1：1000），Cytochrome C（1：1 000）和 β-actin（1：1 000）抗體過夜。用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔（1：2 000）或羊抗鼠（1：2 000）二抗孵育1 h，過氧化物酶的活力被采用ECL顯影的方法檢測(cè)條帶。采用凝膠成像儀上機(jī)檢測(cè)，并用Quantity One軟件定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料均以表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊者組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊者組間兩兩比較用Tamhane′s T2法檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化 不同濃度HLF作用NAFLD的模型細(xì)胞48h，倒置顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。在FFA作用于細(xì)胞后，部分細(xì)胞生長(zhǎng)被抑制，HLF藥物干預(yù)后，細(xì)胞凋亡明顯被抑制。在造模過程中，細(xì)胞在FFA的作用下生長(zhǎng)受到抑制，細(xì)胞的變化主要表現(xiàn)為：細(xì)胞體積變小，分散排列，核漿比例降低，細(xì)胞膜皺縮起泡，細(xì)胞界限表現(xiàn)褶皺和濃染，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)透明空泡，呈輻射狀，葉狀突起。進(jìn)一步發(fā)展，出現(xiàn)細(xì)胞膜出泡和凋亡小體形成。細(xì)胞體積明顯變小，細(xì)胞間隙明顯增大，邊界更清晰，凋亡形態(tài)也更加明顯。通過HLF藥物干預(yù)，隨著濃度的增加，L-02細(xì)胞形態(tài)改變明顯好于低劑量組及模型組。詳見圖1（見插頁(yè)）。

2.2 NAFLD細(xì)胞的凋亡率 Annexin V-FITC標(biāo)記凋亡細(xì)胞，而PI標(biāo)記壞死和中晚期凋亡細(xì)胞。Annexin VFITC代表水平軸的綠色熒光強(qiáng)度，PI代表垂直軸的紅色熒光強(qiáng)度。不同濃度HLF作用NAFLD細(xì)胞48h，隨著HLF濃度的增加，早期和總的凋亡率較未干預(yù)的模型組明顯好轉(zhuǎn)，且與濃度增高相關(guān)，詳見圖2。模型組與正常組相比較，細(xì)胞總凋亡率明顯增高，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；經(jīng)過HLF干預(yù)后，模型組與高劑量組比較，早期凋亡率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），中晚期及總凋亡率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。低劑量組與高劑量組相比較，中晚期凋亡率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見表1。

2.3 NAFLD細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá) 隨著HLF作用濃度的增加，Bax、Cytosolic Cytochrome C蛋白表達(dá)水平逐漸降低，且Cleaved Caspase-9的活化也減少。然而，隨著 HLF作用濃度的增加，Bcl-2、Mitochondria Cytochrome C蛋白表達(dá)水平逐漸增加。詳見圖3。不同濃度HLF作用時(shí)，Bax/Bcl-2的比值，與模型組比較，高、低劑量組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），高、低劑量組之間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；Cytosolic/Mitochondria Cytochrome C的比值，與模型組比較，高、低劑量組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），高、低劑量組之間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；Cleaved Caspase-9蛋白的表達(dá)，與模型組比較，高、低劑量組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），高、低劑量組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.01），詳見表 2。

圖1 不同濃度HLF作用NAFLD細(xì)胞模型48h時(shí)倒置顯微鏡下檢測(cè)形態(tài)學(xué)改變（×400）

圖2 Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)不同濃度HLF作用后NAFLD細(xì)胞的凋亡率（a區(qū)：機(jī)械損傷細(xì)胞，Annexin V-/PI+；b區(qū)：中晚期凋亡和壞死細(xì)胞，Annexin V+/PI+；c區(qū)：早期凋亡細(xì)胞，Annexin V+/PI-；d 區(qū)：正?；罴?xì)胞，Annexin V-/PI-；b+c：總凋亡細(xì)胞）

表1 各組細(xì)胞凋亡率的比較（%）

圖3 Western blot法檢測(cè)不同濃度HLF作用于NAFLD細(xì)胞48h時(shí) 細(xì) 胞 的 Bax、Bcl-2、Mitochondria Cytochrome C、Cytosolic Cytochrome C及Cleaved Caspase-9的蛋白表達(dá)水平

3 討論

NAFLD的發(fā)病目前認(rèn)為與脂肪酸的代謝異常、胰島素抵抗、細(xì)胞的氧化應(yīng)激、肝細(xì)胞的凋亡等方面密切相關(guān)。隨著對(duì)線粒體功能的深入研究，線粒體在細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵作用[9-10]。

表2 各組細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)水平的比較

細(xì)胞凋亡被分為外源性死亡受體通路和內(nèi)源性線粒體通路[11-12]。在內(nèi)源性凋亡途徑中，Bcl-2家族改變線粒體膜電位進(jìn)而打開線粒體孔道，導(dǎo)致線粒體中的細(xì)胞色素C（Cytochrome C）大量釋放，細(xì)胞質(zhì)中增多的Cyt-C（Cytosolic Cyto-chrome C）與ATP和凋亡蛋白酶激活因子（Apaf-1）共同作用，激活了 Caspase-9、Caspase-3和PARP，誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。在線粒體調(diào)控凋亡的系統(tǒng)中，Bcl-2及其家族構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜且相互作用的調(diào)控細(xì)胞凋亡的網(wǎng)絡(luò)[13-15]。在NAFLD的形成過程中，Bcl-2和Bax扮演著重要的角色，脂肪變性和氧化應(yīng)激使得Bax的合成和轉(zhuǎn)移到線粒體外膜的Bax增加，導(dǎo)致線粒體膜構(gòu)型的改變，PT孔開放、細(xì)胞色素C的釋放，引起細(xì)胞的凋亡；Bcl-2主要分布于線粒體外膜，其同源二聚體抑制PT孔開放，且能與Bax結(jié)合，阻止Bax的構(gòu)型變化而起到抗凋亡的作用[16-19]。Cyt-C和Caspase-9均為促凋亡蛋白。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，Bax屬于促凋亡蛋白。兩者的比值決定了細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性甚至可喻為細(xì)胞“凋亡開關(guān)”[20]。

本實(shí)驗(yàn)在顯微鏡下觀察NAFLD細(xì)胞模型的凋亡形態(tài)，發(fā)現(xiàn)在FFA作用細(xì)胞后，模型組細(xì)胞生長(zhǎng)被抑制，部分細(xì)胞可見凋亡；在不同濃度HLF作用后，肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變有一定程度的好轉(zhuǎn)。運(yùn)用Annexin VFITC/PI雙染檢測(cè)NAFLD細(xì)胞的凋亡率，可見模型組細(xì)胞的凋亡率與正常組相比明顯增高，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；經(jīng)過不同濃度HLF干預(yù)后，隨著HLF作用濃度的增加，早期和總的凋亡率較未干預(yù)的模型組明顯好轉(zhuǎn)，隨著濃度增高細(xì)胞凋亡率明顯下降，模型組與高劑量組比較，早期凋亡率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），在中晚期及總凋亡率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。低劑量組與高劑量組相比較，早期凋亡率及總凋亡率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，中晚期凋亡率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。本研究顯示NAFLD肝細(xì)胞在FFA作用細(xì)胞后，模型組細(xì)胞有明顯的形態(tài)學(xué)改變，存在生長(zhǎng)被抑制、出現(xiàn)凋亡小體，通過HLF干預(yù)后，形態(tài)學(xué)改變有明顯好轉(zhuǎn)，肝細(xì)胞的凋亡率有明顯降低且與藥物濃度有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

運(yùn)用Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)的結(jié)果表明，與凋亡密切相關(guān)的 Bax蛋白、Cytosolic Cytochrome C、Cleaved Caspase-9在NAFLD肝細(xì)胞模型中的表達(dá)均較正常組增加，而NAFLD細(xì)胞模型組中Bcl-2蛋白、Mitochondria Cytochrome C蛋白表達(dá)水平明顯低于正常組。經(jīng)過HLF干預(yù)后，隨著HLF濃度的增加Bcl-2蛋白、Mitochondria Cytochrome C蛋白表達(dá)水平較模型組也逐漸增加,而 Bax蛋白、Cytosolic Cytochrome C、Cleaved Caspase-9相應(yīng)減少。本研究還表明，模型組Bax/Bcl-2、CytosolicCytochromeC/MitochondriaCytochrome c的比值、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)均較正常組升高，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；運(yùn)用高、低濃度HLF作用NAFLD肝細(xì)胞時(shí)，Bax/Bcl-2、Cytosolic Cytochrome c/Mitochondria Cytochrome C的比值，Cleaved Caspase-9蛋白的表達(dá)均有不同程度下降，與模型組相比較，HLF高、低劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。降低Bax/Bcl-2和Cytosolic Cytochrome C/Mitochondria Cytochrome C比值的作用，高、低劑量組之間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05或 0.01）；降低Cleaved Caspase-9凋亡蛋白表達(dá)的作用，高、低劑量組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＞0.05）。

結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，Bcl-2、Bax、Cytochrome C、Cleaved Caspase-9均與細(xì)胞內(nèi)源性凋亡相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HLF對(duì)NAFLD細(xì)胞凋亡的影響可能是通過調(diào)節(jié)線粒體 Bcl-2、Bax、Cytochrome C、Cleaved Caspase-9 等相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)，穩(wěn)定線粒體功能而實(shí)現(xiàn)調(diào)控肝細(xì)胞的凋亡。通過調(diào)節(jié)肝細(xì)胞線粒體的功能來延緩或阻止NAFLD的進(jìn)展，為臨床治療NAFLD提供了又一條思路。

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